Информация

Методика проверки устойчивости бактерий к антибиотикам в присутствии другого соединения

Методика проверки устойчивости бактерий к антибиотикам в присутствии другого соединения



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

поэтому я должен «количественно» оценить бактериальный штамм на предмет его устойчивости к антибиотикам (это специфический антибиотик) в присутствии и в отсутствие другого соединения наряду с антибиотиком. Какой метод или протокол можно использовать?


Похоже, вы могли бы использовать «Тест диффузии диска», описанный в этой статье в Википедии. Это может быть сделано с вторичным адъювантным соединением и без него и может быть определено количественно путем измерения различных диаметров образующихся зон бактериального ингибирования.

https://en.wikipedia.org/wiki/Disk_diffusion_test


Устойчивость к антибиотикам бактерий, выделенных из креветочных заводов и культурных прудов на острове Дунхай, Китай

Устойчивость бактерий к 12 различным антибиотикам была исследована на креветочных фермах на острове Дунхай, Китай. Было обнаружено, что устойчивые к антибиотикам бактерии широко распространены на креветочных фермах, что указывает на высокий экологический риск. Кроме того, были обнаружены значительные различия в штаммах бактерий между фермами (ANOVA, п & lt 0,05), демонстрируя устойчивость к антибиотикам, таким как ампициллин, триметоприм, соединение синоми, тетрациклин, хлорамфеникол и цефазолин. Не было обнаружено значительных различий в устойчивости к антибиотикам среди 6 инкубаториев, оцениваемых в этом исследовании (ANOVA, п & gt 0,05), между возвышенными и традиционными прудами с креветками (ANOVA, п & gt 0,05), а также между культурными прудами и соответствующими контрольными участками источников воды (Т-тестовое задание, п & gt 0,05). В культурных прудах не было обнаружено значительных различий в устойчивости бактерий к антибиотикам между водой и донными отложениями (Т-тестовое задание, п & gt 0,05), а устойчивость бактерий к антибиотикам из воды показала значительную положительную корреляцию с устойчивостью бактерий из отложений (п & lt 0,05). Таким образом, наше исследование показывает, что множественная бактериальная устойчивость к антибиотикам (MAR) более распространена в креветочных хозяйствах, чем в прудах.

Особенности

► Мы оцениваем частоту возникновения антибактериальной устойчивости к 12 антибиотикам на острове Дунхай, Китай. ► Антибиотики широко используются в прудах для разведения креветок и в рыбопитомниках. ► Устойчивые к антибиотикам бактерии широко распространены из-за перекрестного загрязнения, что указывает на высокий экологический риск.


ВСТУПЛЕНИЕ

Выявление и использование лекарственных растений являются важными компонентами здоровья и благополучия различных групп населения в развивающихся странах. Кроме того, растения, обладающие антибактериальными свойствами, становятся все более актуальными в эпоху, когда медицинские работники документируют рост устойчивости к антибиотикам среди патогенных бактерий. Моринга масличная (моринга) - это дерево, которое родом из Индии и использовалось как в качестве пищевой добавки, так и в качестве лекарственного растения (1 & # x020135). На основании нашего собственного исследования (неопубликованного) и исследований нескольких других групп (4, 6 & # x020138) экстракты листьев, семян и корней моринги проявляют антибактериальные свойства. Allium sativum (чеснок) также обладает антибактериальными свойствами (9, 10). Эти тормозящие эффекты можно легко продемонстрировать в поучительных лабораторных упражнениях с высокой степенью визуализации.

Для определения антибактериального действия различных веществ можно использовать несколько методов, но метод дисковой диффузии (11) является одним из наиболее экономически эффективных, простых и визуально ярких доступных методов. Этот метод дает четкие результаты, которые легко наблюдаются и интерпретируются студентами, проводящими эксперимент. Здесь мы описываем лабораторные занятия, в которых студентов проинструктировали, как извлекать антибактериальные соединения из растений, асептических бактерий и проверять экстракты на антибактериальную активность. После 24-часового инкубационного периода студенты проанализировали свои результаты и собрали данные, касающиеся ингибирующего действия тестируемых растительных экстрактов на рост грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Студентам был предложен идентичный необъявленный тест непосредственно перед (до лабораторной работы) и через одну неделю (после лабораторной работы) лабораторной деятельности, чтобы оценить, улучшилось ли их понимание концепций и процедур после выполнения лабораторного упражнения. Студенты также дали оценку лабораторной деятельности, заполнив послелабораторный опрос.

Целевая аудитория

Благодаря своей междисциплинарной природе, сочетающей концепции микробиологии и биологии растений, эта лабораторная деятельность подходит для ряда программ бакалавриата по биологии. Сюда могут входить курсы типа «Принципы биологии» для новичков, биология растений (ботаника), общая микробиология и медицинская микробиология. Это также подходящее занятие для любого курса, посвященного лекарственным растениям, природоохранной биологии или тропическому сельскому хозяйству.

Необходимые знания студента

Студенты бакалавриата, успешно завершившие курс биологии в средней школе, должны обладать достаточными базовыми знаниями для выполнения этого задания, предполагая, что также предоставляется предлабораторная лекция, охватывающая основные концепции бактериальной культуры и клеточной структуры (грамположительные или грамотрицательные) (см. & # x0201cИнструкции по ошибкам & # x0201d). Кроме того, ожидается, что студенты выполнили требования курса по лабораторной безопасности, которые должны включать в себя описание рекомендаций по использованию организмов с уровнем биобезопасности (BSL) 1 (см. & # X0201cПроблемы безопасности & # x0201d). По окончании обучения студенты получат базовое понимание роста и контроля микробов, а также навыки безопасного обращения с живыми микроорганизмами, включая использование асептических методов и правильную утилизацию биологически опасных материалов. Преподаватели должны изучить эти концепции во время объяснения и демонстрации перед лабораторией.

Время обучения

Для выполнения этой работы необходим один двухчасовой лабораторный период для сбора экстрактов растений, взятия мазков из стерильных чашек агара Мюллера-Хинтона с предоставленными бактериальными культурами и нанесения экстракта растений и дисков с антибиотиками на чашки для инкубации при 37 ° C. # x000b0C. После 24-часовой инкубации учащиеся должны немедленно собрать экспериментальные результаты или охлаждать чашки с культурами при температуре 4 ° C для сбора данных в следующем лабораторном периоде. Учащиеся должны уметь измерять и интерпретировать свои результаты за 15–30 минут.

Цели обучения

После успешного выполнения этого лабораторного упражнения студенты смогут:

Извлеките водорастворимые продукты из растений, потенциально имеющих лекарственное значение, и определите их антибактериальную активность.

Установите бактериальные культуры на чашках Петри, используя асептический метод.

Определите количество антибактериальных эффектов растительных экстрактов и известных антибиотиков путем выявления, измерения и сравнения зон подавления роста бактериальной культуры на чашке.

Сравните эффект ингибирования роста растительных экстрактов и известных антибиотиков на грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Сформулируйте гипотезу, объясняющую функцию антимикробных препаратов в растениях.

Обозначьте потенциальное использование растений для борьбы с бактериальными инфекциями.


2. Определение и методы

2.1. Что такое ВПК?

МИК - это самая низкая концентрация антибактериального агента, выраженная в мг / л (& # x003 мкг / мл), которая в строго контролируемых условиях in vitro полностью предотвращает видимый рост тестируемого штамма организма [2].

2.2. Методы определения МИК

Используются следующие методы:

полоски, пропитанные заранее заданным градиентом концентрации антибиотика

2.2.1. Методы разведения

EUCAST [3] в основном рекомендует микроразбавление в бульоне, за исключением фосфомицина и мециллинама, для которых он рекомендует разведение в агаре. Американский CLSI [4], с другой стороны, допускает взаимозаменяемое использование бульона и разведения агара для большинства бактерий и антибиотиков. Исключения составляют H. influenzae штаммы и антибиотики колистин и даптомицин, для которых МИК может быть определена только путем разбавления бульона, и фосфомицин, для которых, как и в руководящих документах EUCAST, МИК может быть измерена с использованием метода разбавления в агаре. Кроме того, CLSI рекомендует среду HTM для H. influenzae вместо бульонной среды MH & # x02013F, рекомендованной EUCAST.

Для определения значений MIC во всех количественных методах используется среда Мюллера & # x02013Hinton (MH) либо в форме агара (MHA), либо в виде бульона (MHB), в некоторых случаях с добавлением, например, 5% лизированной крови лошади или других соединений в зависимости от по типу бактерий или антибиотиков (Таблица 1). Только для анаэробных бактерий используется агар Brucella с гемином (5 мкг / мл), витамином К (1 мкг / мл) и 5% лизированной лошадиной кровью [4,5].

Таблица 1

Среды, дополнительные добавки и контрольные штаммы для определения МИК методами разведения согласно EUCAST [3].

Бактериальные штаммыОпределение МИККонтрольные штаммы
Разведение бульонаРазведение агара
Бульон Мюллера-Хинтона (MHB)MHB + дефибринированная лошадиная кровь и & # x003b2-NAD (MH-F)Дополнительная добавкаMHAДополнительная добавка
Enterobacteralesвсе антибиотики, кроме фосфомицина и мециллинама--фосфомицинMHA + 25 мг / л глюкозо-6-фосфатаКишечная палочка ATCC 25922, только ингибиторы:
ATCC Кишечная палочка 35218 или
K. pneumoniae 700603
Enterobacteralesвсе антибиотики, кроме фосфомицина и мециллинама--мециллинам-Кишечная палочка ATCC 25922, только ингибиторы:
ATCC Кишечная палочка 35218 или K. pneumoniae 700603
Псевдомонады видывсе антибиотики, кроме фосфомицина --фосфомицин MHA + 25 мг / л глюкозо-6-фосфатаP. aeruginosa
ATCC 27853
Stenotrophomonas maltophiliaко-тримоксазол----Кишечная палочка ATCC 25922
Acinetobacter видывсе антибиотики----P. aeruginosa
ATCC 27853
Стафилококк видывсе антибиотики, кроме фосфомицина-MHB + 2% NaCl для оксациллина, метициллина, нафциллинафосфомицин MHA + 25 мг / л глюкозо-6-фосфатаS. aureus
ATCC 29213
Стафилококк видывсе антибиотики, кроме фосфомицина-MHB + 50 мг / л Ca ++ для даптомицина--S. aureus
ATCC 29213
Стафилококк видывсе антибиотики кроме фосфомицина-MHB + 0,002% полисорбат 80 для далбаванцина, оритаванцина, телеванцина--S. aureus
ATCC 29213
Энтерококк видывсе антибиотики----E. faecalis
ATCC 29212
Streptococcus A, B, C, G gr.-все антибиотикиБульон MH-F + 0,002% полисорбат 80 для далбаванцина, оритаванцина, телеванци--S. pneumoniae
ATCC 49619
Пневмококк-все антибиотики---S. pneumoniae
ATCC 49619
Streptococcus gr. вириданс-все антибиотикиБульон MH-F + 0,002% полисорбат 80 для далбаванцина, оритаванцина, телеванци--S. pneumoniae
ATCC 49619
Гемофильный
грипп
-все антибиотики---H. influenzae
ATCC 49766
Moraxella
катаральный
-все антибиотики---H. influenzae
ATCC 49766
Листерия
моноцитог
enes
-все антибиотики---S. pneumoniae
ATCC 49619
Пастерелла
Multocida
-все антибиотики---H. influenzae
ATCC 49766
Коринебактерии виды -все антибиотики---S. pneumoniae
ATCC 49619
Kingella kingae -все антибиотики---H. influenzae
ATCC 49766
Aeromonas
sanguinicola и моча
-все антибиотики---P. aeruginosa
ATCC 27853

Для определения МПК с помощью методов разбавления также необходимы антибиотики в веществе, которое требует предварительного растворения для получения исходного раствора, а затем разбавления для получения подходящей начальной концентрации. Для большинства антибиотиков вода является одновременно растворителем и разбавителем, в том числе для большинства бета-лактамов, фторхинолонов и аминогликозидов. Некоторым в качестве растворителя требуется спирт, особенно макролиды, хлорамфеникол и рифампицин, в то время как другим требуется фосфатный буфер или диметилсульфоксид ДМСО (таблица 2). Растворенные и разведенные антибиотики используются для приготовления рабочих растворов в бульоне Мюллера-Хинтона или агаре [6,7].

Таблица 2

Растворители и разбавители для различных антибиотиков [6].

АнтибиотикиРастворительРазбавитель
пенициллиныпенициллин, метициллин, нафциллин, оксациллин, азлоциллин, мециллинам, мезлоциллин, карбенициллин, пиперациллинводы
амоксициллин, тикарциллинфосфатный буфер pH 6,0, 0,1 моль / л
ампициллинфосфатный буфер pH 8,0, 0,1 моль / лфосфатный буфер pH 8,0,
0,1 моль / л
ингибиторы бета-лактама
бета-лактамаз
сульбактам, тазобактам,воды
клавулановая кислота,фосфатный буфер pH 6,0, 0,1 моль / л
не бета-лактамные ингибиторы бета-лактамазавибактам, релебактамводы
цефалоспориныцефаклор, цефамандол, цефоницид, цефоперазон, цефотаксим, цефокситин, цефтозоксим, цефтоплозан, цефтриаксонводы
цефазолин, цефепим, цефуроксимфосфатный буфер pH 6,0, 0,1 моль / л
цефтазидимкарбонат натрияВоды
цефтаролинДМСОФизиологический раствор
цефалексин, цефалотин, цефрадинфосфатный буфер pH 8,0, 0,1 моль / лводы
карбапенемыфаропенем, меропенемводы
эртапенемфосфатный буфер pH 6,0, 0,1 моль / л
имипенем, эртапенемфосфатный буфер pH 7,2 0,01 моль / л
меропенем-варборбактамДМСОводы
аминогликозидыамикацин, гентамицин, канамицин, нетилмицин, стрептомицин, плазомицин, тобрамицинводы
линкозамидыклиндамицинводы
макролидыазитромицин95% этанолбульон средний
кларитромицинметанолфосфатный буфер pH 6,5, 0,1 моль / л
эритромицин95% этанолводы
хинолоныцинафлоксацин, финафлоксацин, гареноксацин, гатифлоксацин, гемифлоксацин, моксифлоксацин, спарфлоксацин, офлоксацин *, левофлоксацин *, норфлоксацин *воды
тетрациклинытетрациклин, миноциклин, доксициклин, тигециклин, эравациклинводы
полимиксиныколистин, полимиксин Вводы
гликопептидытейкопланин, ванкомицинводы
телаванцинДМСО
липогликопептидыдалбаванцинДМСО
циклический липопептиддаптомицинводы
оксазолидинонылинезолидводы
тедизолидДМСО
другие антибиотикифосфомицин, фузидовая кислота, мупироцин, хинупристин-далфопристин, воды
фидаксомицин, метронидазолДМСОводы
хлорамфеникол95% этанолводы
рифампицинметанол воды

* 1/2 объема воды, затем по каплям 0,1 моль / л NaOH для растворения, ДМСО & # x02014 Диметилсульфоксид.

Рабочие растворы должны содержать двойные разведения антибиотиков, с диапазоном концентраций, используемых для тестирования, в зависимости от рассматриваемого лекарства и с учетом контрольных точек МИК для эталонных штаммов [6]. Последующие двойные разведения антибиотика следует проводить по схемам, представленным в документах [6] и предложенным EUCAST [8].

В методе микроразбавления бульона приготовленные рабочие растворы с двойными разведениями антибиотиков распределяют в соответствующие лунки микротитровальных планшетов, и в этой форме их можно использовать либо непосредственно для определения МИК, либо хранить в пластиковых пакетах до трех месяцев при температуре окружающей среды. температура & # x02264 & # x0221260 & # x000b0C [6]. Исключением является тигециклин, для которого определение МИК должно проводиться в течение 12 часов после приготовления среды MHB. Это связано с тем, что со временем в среде накапливается кислород, который, в свою очередь, снижает активность тигециклина [3,4,6,9].

В методе разбавления агаром каждую из полученных концентраций антибиотика в объеме 1 мл добавляют к 19 мл еще жидкой среды MHA при температуре 45 ° C и разливают на чашки Петри диаметром 9 см. [8].

Бактериальный инокулят

Бактериальную суспензию следует готовить из морфологически похожих колоний, культивированных в течение ночи на неселективной твердой или жидкой среде. Посевной материал, обрабатываемый последующими разведениями антибиотика, должен иметь следующие окончательные значения в соответствующих методах:

метод микроразбавления бульона 5 & # x000d7 10 5 КОЕ (колониеобразующих единиц) / мл [6]

метод разведения в агаре 1 & # x000d7 10 4 КОЕ / пятно [7,8]

Чтобы получить любую из вышеуказанных бактериальных суспензий, сначала следует приготовить суспензию 0,5 МакФарланда.

Чтобы получить бактериальную суспензию с плотностью 5 & # x000d7 10 5 КОЕ / мл для целей микроразбавления бульона, суспензию МакФарланда 0,5 следует развести на 100 & # x000d7 до плотности 10 6 КОЕ / мл (9,9 мл бульона + 0,1 мл 0,5 McFarland), а затем вылили в лунки, содержащие соответствующие концентрации антибиотика в бульоне (50 мкл бактериального инокулята + 50 жидкой среды с антибиотиком или 10 мкл инокулята на 100 мкл разбавленного антибиотика). Если в лунках используются коммерческие тесты с лиофилизированным антибиотиком, следует немедленно получить суспензию 5 & # x000d7 10 5 путем добавления 50 & # x003bcL 0,5 суспензии МакФарланда к 10 мл бульона). S. pneumoniae требуется перенос 100 мкл 0,5 суспензии МакФарланда в 10 мл бульона для получения конечного инокулята 5 мкл х000d7 10 5 КОЕ / мл [10].

Для метода разбавления агаром конечный посевной материал 1 & # x000d7 10 4 КОЕ / пятно получают путем разбавления 0,5 суспензии МакФарланда 10 & # x000d7 в NACL или бульоне и нанесения 1 & # x003bcL такой суспензии на среду MHA с последующими разведениями антибиотика. [8].

В течение 30 минут после приготовления посевной материал следует добавить в жидкую среду или поместить на твердую среду с антибиотиком, чтобы сохранялась плотность клеток (КОЕ / мл). Тесты следует инкубировать при температуре 35 ° C в течение 18 часов (полные 24 часа необходимы, особенно для гликопептидов и оксациллина [6], а также для тестирования Стрептококк виды а также Гемофильный виды штаммы [10]. Инкубацию следует проводить в аэробных условиях. Только в исключительных случаях для таких штаммов, как Neisseria spp., инкубация проводится в атмосфере, обогащенной 5% CO.2 [8] или для анаэробных бактерий - в анаэробных условиях в течение 48 часов [5].

Бактериальный посевной материал следует контролировать, поскольку он оказывает большое влияние на надежность тестов MIC. Получение 0,5 суспензии МакФарланда контролируют измерениями на денситометре или спектрофотометре, где оптическая плотность на длине волны 625 нм должна находиться в диапазоне от 0,08 до 0,13 [9,11]. Посевной материал, полученный в лунках микротитровального планшета, также следует контролировать. С этой целью при использовании микроразбавления бульона необходимо отобрать 10 мкл из лунки с контролем роста (среда MHB с бактериальной суспензией и без антибиотика) и добавить к 10 мл бульона или соли, а затем 100 мкл из такого разведения. следует поместить на твердую среду, хорошо распределить по среде MHA и инкубировать в течение 12 месяцев при температуре 35 ° C. Получение роста 20 & # x0201380 колоний данного бактериального штамма доказывает плотность 5 & # x000d7 10 5 КОЕ / мл [6].

В каждом из методов необходимо осуществлять контроль качества путем контроля стерильности среды, роста штаммов и качества результатов, полученных путем оценки МПК тестируемого антибиотика для эталонных штаммов, список которых приведен в таблице 1. Эталонные штаммы, перечисленные в таблице 1, рекомендованы как EUCAST, так и CLSI [3,4]. Полученные значения MIC для эталонных штаммов должны находиться в диапазоне концентраций, рекомендованных EUCAST и CLSI [4,12].

Чтение результатов

Значение МИК - это самая низкая концентрация антибиотика, при которой рост бактерий полностью подавляется. В методе разбавления агаром не учитываются рост колоний 1 & # x020132 или слабая дымка [7,8]. В методе микроразбавления бульона для некоторых антибиотиков используются отдельные правила считывания значения МИК [13], в том числе для следующих:

бактериостатические антибиотики против грамположительных бактерий (хлорамфеникол, тетрациклин, клиндамицин, эритромицин, линезолид, тедизолид) и против грамотрицательных организмов (тигециклин, эравациклин): не обращайте внимания на точечный рост на дне лунки.

триметоприм-сульфаметоксазол для всех бактерий: считайте МИК при самой низкой концентрации, которая ингибирует рост на & # x0226580% по сравнению с контролем роста.

Для облегчения считывания в методе микроразведения бульона можно использовать резазурин (слабо флуоресцентный синий краситель), который активными бактериями восстанавливается до флуоресцентного резоруфина (розовый) [14]. Необходимо повторить тесты, в которых не наблюдается роста при более низких концентрациях антибиотика и видимый рост бактерий при более высоких концентрациях. Это может быть связано с несколькими причинами, включая технические ошибки, связанные, например, с несоответствующим разведением антибиотика. Однако причина эффекта Eagle & # x02019s гораздо интереснее. Это относится к бактериям, которые, как это ни парадоксально, обладают повышенной способностью к выживанию в присутствии бактерицидной концентрации антибиотика выше оптимальной [15]. Это явление было впервые описано ученым Гарри Иглом в 1948 году в отношении пенициллина. В настоящее время эффект Игла обнаружен для ряда антибиотиков, таких как бета-лактамы, гликопептиды, фторхинолоны, аминогликозиды, полимиксины, рифампицин. Это также наблюдается в случае различных микроорганизмов, в том числе Стафилококк виды, Стрептококк виды, Энтерококк spp., и грамотрицательные, в частности бета-лактамазоположительные бактерии. Интересно, что этого не происходит ни у бета-лактамаз-отрицательных бактерий, ни в присутствии ингибиторов бета-лактама. В клинических условиях эффект Орла приводит к неэффективности лечения из-за применения чрезмерной дозы антибиотика. Исследования показали, что концентрации ванкомицина 20 & # x000d7 МИК или выше применяются против E. faecalis или Clostridium difficile способствовали скорее бактериостатическому, чем бактерицидному эффекту гликопептида. Напротив, концентрации до 9 & # x000d7 МИК были эффективными и приводили к положительному клиническому исходу [16,17]. Механизмы, лежащие в основе эффекта Орла, до конца не изучены. Научное внимание сосредоточено на возможном увеличении продукции бета-лактамаз из-за высокой концентрации антибиотика, снижении экспрессии PBP (связывающих пенициллин белков) в стационарной фазе бактерий или окислительном стрессе, вызванном хинолонами [15].

2.2.2. Градиентный метод

Определение МИК градиентным методом намного проще, чем методы разбавления. Использование тест-полосок E-test, пропитанных заданным градиентом концентраций антибиотиков, делает этот метод простым, быстрым и применимым в рутинной микробиологической диагностике. К сожалению, в последние годы использование диско-диффузионного метода с использованием полосок значительно сократилось. Оказалось, что он дает ненадежные определения чувствительности к колистину и ванкомицину у Staphylococcus spp. штаммов или фосфомицину [3,4]. В случае колистина этот метод обычно дает более низкие значения МИК, чем метод микроразбавления эталонного бульона. Следовательно, он обычно не позволяет идентифицировать резистентные штаммы [18,19,20]. Вышесказанное объясняется как размером молекулы полимиксина (что является причиной того, что она имеет ограниченные возможности диффузии из полоски), так и возможным взаимодействием с пластиком, из которого сделана полоска [21,22]. В мае 2019 года на сайте EUCAST также появилось предупреждение о возможности получения ложноотрицательных результатов при использовании градиентных тестов при оценке устойчивости штаммов рода к ванкомицину. Энтерококк виды и при оценке чувствительности Пневмококк бензилпенициллину [23,24]. Отказ от этого метода определения МИК некоторых антибиотиков в конечном итоге привел к сокращению выдачи результатов, включая оценку чувствительности к колистину или все более распространенному фосфомицину. Он не был заменен методами разбавления, потому что большинство лабораторий не могут использовать их в своей повседневной работе. Поэтому продолжаются исследования для оценки пригодности полосок для тестирования бактериальной чувствительности к лекарственным средствам с учетом влияния различных факторов на результаты. В последние годы появились сообщения о том, что усиление среды MHA кальцием может повысить надежность определения МИК колистина. В своих исследованиях Gwo & # x0017adzi & # x00144ski et al. [25] показали высокий процент существенного совпадения (EA) значения MIC, определенного с использованием градиентного метода на среде с повышенным содержанием кальция, по сравнению с эталонным методом (микроразбавление в бульоне), но только для чувствительных к колистину штаммов. EA для устойчивых штаммов была намного ниже (13%), хотя категориальное согласие (CA) было выше и составило 87%. Недавнее исследование из США, опубликованное в 2020 году [26], показывает, что добавление кальция не приносит ожидаемого повышения надежности градиентного метода определения МПК колистина, поскольку EA и CA составили 65,5% и 73,7% соответственно для все протестированные грамотрицательные микроорганизмы, в том числе чувствительные и устойчивые к колистину. Аналогичным образом продолжается работа по оценке того, действительно ли градиентный тест не позволяет надежно оценить МПК фосфомицина. Проведенные до сих пор исследования дают разные результаты. По мнению некоторых авторов, значения МИК, определенные с помощью тест-полосок, выше, чем полученные с помощью эталонного метода, поэтому устойчивые к фосфомицину штаммы [27,28] чаще встречаются при использовании полосок в качестве метода тестирования. Flam et al. предполагают, что штаммы, у которых обнаружена устойчивость с помощью тест-полосок, следует проверять с помощью теста на разведение в агаре [25]. В другом исследовании итальянские авторы обнаружили 100% СА между градиентным и эталонным методами для Кишечная палочка БЛРС (+) и Клебсиелла пневмонии NDM / OXA-48 [29]. Однако в настоящее время градиентный тест не разрешен для определения МИК фосфомицина американскими регулирующими органами [4], и EUCAST также не рекомендует его в качестве эталонного метода [3], хотя некоторые национальные рекомендации (например, польские) разрешают его приложение [30].

Для градиентного метода требуется суспензия 0,5 МакФарланда для всех типов бактерий, кроме суспензии, полученной из Пневмококк выращены на чашке с шоколадным агаром, для чего следует использовать 1 суспензию МакФарланда [3]. Считывание значения MIC с помощью градиентной полоски E-test сложнее, чем выполнение самого теста. Это может зависеть от тестируемого бактериального штамма, антибиотика (в частности, является ли он бактериостатическим или бактерицидным), механизма устойчивости, присутствия гетерогенно устойчивой популяции и даже от способа проведения теста градиентной полоски E-test. Следовательно, оценки MIC следует проводить в соответствии с инструкциями производителя, которые принимают во внимание такие факторы [31]. Вышеупомянутый фосфомицин может быть здесь примером, для которого рост отдельных колоний в зоне задержки роста не должен учитываться при определении значения MIC [32].


Быстрый способ определения устойчивости бактерий к антибиотикам

Способность бактерий становиться устойчивыми к антибиотикам становится все более серьезной проблемой в здравоохранении: устойчивые штаммы приводят к длительным заболеваниям и более высокому уровню смертности.

Один из способов борьбы с этим - определение устойчивости бактерий к антибиотикам у конкретного пациента, но это часто занимает дни, а время имеет решающее значение в лечении. Ученые ASU разработали методику, с помощью которой можно отделить устойчивые к антибиотикам бактерии от «восприимчивых» бактерий, и это происходит за считанные минуты.

Микрожидкостная технология, разработанная в лаборатории профессора Марка Хейса на факультете химии и биохимии Университета штата Аризона, использует микромасштабные градиенты электрического поля, воздействующие на очень маленькие образцы, чтобы отличить два штамма (устойчивый к антибиотикам и антибиотик). -чувствительный) из Стафилококк эпидермид.

Это часть меняющегося подхода к бактериям.

После многолетнего «кувалдного» подхода, направленного на уничтожение всех бактерий с помощью мыла, моющих средств, антибиотиков и дезинфицирующих средств для рук, ученые теперь переходят к более тонким методам, основанным на лучшем понимании сложной бактериальной системы в нашем организме и в мире вокруг нас.

В теле среднего человека и на его теле находится более 100 триллионов микробов. Это в девять раз больше клеток, составляющих все человеческое тело. В тот момент, когда мы рождаемся, в наши тела проникают армии бактерий, незваные, но необходимые гости. Без них нам не обойтись.

В результате эволюции бактерии обладают способностью быстро принимать полезные геномные изменения. Один из типов адаптации - устойчивость к антибиотикам, и это становится огромной проблемой во всем мире.

Национальные сводные данные Центров по контролю и профилактике заболеваний показывают, что каждый год в Соединенных Штатах не менее 2 миллионов человек заражаются серьезными инфекциями, вызванными устойчивыми к антибиотикам штаммами бактерий. По крайней мере 23000 человек умирают в результате этих инфекций, и гораздо больше людей умирают от связанных с ними осложнений.

Эта растущая адаптация угрожает не только людям. Исследование, опубликованное в Наука только на прошлой неделе было обнаружено множество африканских диких животных, в которых обитают устойчивые к лекарствам микробы, похожие на те, что встречаются у людей, живущих в близлежащих деревнях.

Адаптация к устойчивости к антибиотикам - естественное явление. Когда используется антибиотик, бактерии, которые могут сопротивляться этому антибиотику, очевидно, имеют больше шансов на выживание, чем те, которые чувствительны, и поэтому устойчивость передается следующему поколению.

Некоторые из наиболее известных устойчивых к антибиотикам штаммов и видов принадлежат к роду Стафилококк. Их обычно классифицируют как патогенные или непатогенные в зависимости от продукции фермента коагулазы. Стафилококк эпидермис не вырабатывает коагулазу и, как правило, менее инвазивен, чем Золотистый стафилококк. Фактически, это нормальный и комменсальный житель человеческой кожи.

Однако в последние десятилетия Стафилококк эпидермис все чаще становится причиной госпитальных инфекций с множественной устойчивостью. Пациенты с ослабленным иммунитетом, постоянные медицинские устройства и имплантированные хирургическим путем протезы обеспечивают подходящую среду для Стафилококк эпидермид для размножения и образования биопленок.

Именно здесь начался проект в сотрудничестве с хирургом-ортопедом доктором Алексом Маклареном и членом его команды и биоинженером доктором Райаном МакЛемором из медицинского центра Banner Good Samaritan, Феникс, а также доктором Марком Спангелем из медицинского колледжа клиники Майо. Аризона.

По большинству показателей устойчивые к антибиотикам и чувствительные штаммы Стафилококк эпидермис фенотипически идентичны и, таким образом, представляют собой серьезную проблему для традиционных методов аналитического разделения. Именно здесь технология ASU находит свое место.

Современные клинические подходы к определению устойчивости к антибиотикам часто требуют двух или более дней для получения результатов. Обычно они полагаются на лечение бактерий антибиотиками, а затем на наблюдение за моделями роста колоний. Длительное время обработки приводит к большей зависимости от противомикробных препаратов широкого спектра действия и, как правило, приводит к субоптимальным результатам для пациентов (включая повышение уровня смертности).

Ученые из группы Хейса на кафедре химии и биохимии АГУ, которая вскоре станет Школой молекулярных наук, создают портативное устройство с батарейным питанием, которое может доставлять ответы в считанные минуты, а не дни.

Идентификация происходит в микроскопически маленьком канале в чипе из стекла и силиконового полимера. Микроканал имеет пилообразную форму, что позволяет исследователям сортировать и концентрировать микробы на основе их уникальных электрических свойств.

Явление, которое заставляет эту работу работать, называется диэлектрофорезом, который включает в себя приложенное напряжение, которое воздействует на бактерии. Эта сила действует как сортировщик монет, заставляя бактерии задерживаться в разных точках канала. Где они останавливаются и при каком напряжении, зависит от их молекулярных и электрических свойств.

Используя этот подход, команда Хейса, включая аспирантов Пола В. Джонса и Шеннон (Хьюи) Хилтон, разделила очень похожие бактерии - устойчивые к гентамицину (антибиотикам) и чувствительные. Их результаты недавно опубликованы в журнале. Аналитик.

«Для пациента и врача важно сразу же получить правильный ответ. Развивая фундаментальную область науки, мы можем создать совершенно новый способ дифференциации этих микроорганизмов», - сказал Хейс.

«И оказывается, что у нас есть базовый механизм, который можно интегрировать со смартфонами и широко и дешево распространять. Честно говоря, мы только надеялись, что эта стратегия может работать так хорошо, хотя наши теоретические расчеты показывают, что это возможно».

Исследователи флуоресцентно пометили два штамма (каждый с разным красителем) Стафилококк эпидермид чтобы их можно было визуально различить в процессе разделения. Они вводили ячейки в каждый канал и просто подавали напряжение, чтобы направить ячейки вниз по потоку. Геометрические особенности канала формируют электрическое поле, создавая области разной напряженности. Это поле создает диэлектрофорезную силу, которая позволяет одним клеткам проходить, в то время как другие улавливают в зависимости от их фенотипа.

Такое разделение имеет серьезные потенциальные последствия для здравоохранения, поскольку быстрое и раннее выявление значительно улучшит терапевтические результаты. Текущие результаты создают основу для биофизического разделения в качестве инструмента прямой диагностики, потенциально улучшающего почти все показатели качества диагностики и рационального использования антибиотиков.


4. Важность значений МПК в клинической практике.

Как и зона подавления роста бактерий в качественном методе, значение MIC служит основой для оценки категории чувствительности или устойчивости возбудителя к данному антибиотику. Согласно рекомендациям EUCAST [39], с 01.01.2019 были введены две категории восприимчивости и одна категория устойчивости:

Чувствительный (S), стандартный режим дозирования: существует высокая вероятность терапевтического успеха при использовании стандартного режима дозирования агента.

Восприимчивый (I), повышенное воздействие: существует высокая вероятность терапевтического успеха, поскольку воздействие агента увеличивается за счет корректировки режима дозирования или его концентрации в очаге инфекции.

Устойчивый: высока вероятность терапевтического сбоя даже при повышенном воздействии.

Главный сдвиг в клинической интерпретации результатов касается штаммов бактерий, классифицированных к концу 2018 года как промежуточно чувствительные к антибиотикам (I). Такие штаммы ранее включались в эпидемиологические отчеты как устойчивые. С клинической точки зрения изменение определения & # x0201cI & # x0201d подразумевает значительное изменение интерпретации результатов.

Оба, антибиотик с новой категорией чувствительности & # x02013I и антибиотик с категорией -S, вносят вклад в одинаковую степень клинической эффективности.

Для достижения терапевтического успеха с категорией & # x0201cI & # x0201d следует использовать высокие дозы антибиотика, следует сократить интервал дозирования или изменить способ введения (например, следует применять непрерывные или продолжительные инфузии). Вариант, выбранный для увеличения воздействия, зависит от типа антибиотика и его фармакокинетических / фармакодинамических параметров (PK / PD) (обсуждаемых ниже в этом обзоре). Однако EUCAST подготовил таблицу с правилами дозирования с учетом стандартного дозирования для категории S и высоких доз для новой категории I (дозы были обновлены в 2021 году, версия 11.0). Это облегчает принятие решения относительно дозировки или способа введения лекарственного средства. Основываясь на новых правилах интерпретации значений МИК, использование, например, высоких доз ципрофлоксацина, то есть 0,75 г & # x000d7 2 перорально или 0,4 г & # x000d7 3 в / в, может способствовать искоренению Синегнойная палочка штамм с категорией чувствительности I к этому антибиотику (0,001 & # x0003c MIC & # x0003c 0,5 мг / л) [40]. Wantia et al. показали, что знания медицинских работников о новых критериях клинической интерпретации, особенно в отношении штаммов категории I, должны быть немедленно улучшены [41]. Правильная клиническая интерпретация приведет к включению антибиотиков категории (I) в терапевтические возможности, поэтому существует повышенная потребность в обучении медицинских работников новым правилам клинической интерпретации значений МПК.

Для некоторых антибиотиков и бактерий определение МИК является единственным надежным фенотипическим методом оценки лекарственной чувствительности, поскольку качественные методы дали ложные результаты (таблица 3) [3,4]. Причина может заключаться в плохом проникновении антибиотика в агар, как это происходит в случае с полимиксином или альтернативным даптомицином, из-за невозможности отличить изоляты дикого типа от изолятов с устойчивостью к гликопептидам, не опосредованной vanA. Стафилококк виды Для анаэробных бактерий ложные результаты могут быть получены из-за неопределенных точек останова [40,42,43]. Что касается даптомицина, также трудно получить подходящую концентрацию ионов кальция в агаре, которые необходимы для оценки чувствительности бактерий. Все вышеперечисленные факты делают диск-диффузионный метод не рекомендуемым [44].

Таблица 3

Антибиотики и патогены, чувствительность к которым может быть определена только методами количественного фенотипа.

Антибиотик (ы)Группа бактерий
фосфомицинEnterobacterales Кроме Кишечная палочка, Стафилококк виды
тигециклинEnterobacterales Кроме Кишечная палочка, Citrobacter koserii
колистинвсе грамотрицательные стержни
все антибиотикиNeisseria виды, анаэробы
бета-лактамынечувствительный к пенициллину Пневмококк
гликопептиды / липогликопептидыСтафилококк виды
далбаванцин, оритаванцин Группа стрептококков: Viridans, A, B, C, G

Кроме того, в отличие от качественных методов, значение МПК позволяет оценить степень чувствительности или устойчивости к антибиотику. Информация о степени восприимчивости имеет большое эпидемиологическое и клиническое значение, но ее необходимо правильно интерпретировать. Различия в степени восприимчивости штаммов к антибиотикам нельзя оценить путем прямого сравнения значений МПК, полученных для таких антибиотиков, что, к сожалению, иногда и проводится. Такая интерпретация приводит к ошибочному мнению, что штамм наиболее чувствителен к антибиотику, для которого МИК самая низкая. EUCAST значительно облегчил оценку степени чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, введя новые критерии для интерпретации результатов. По этим критериям различают два уровня восприимчивости штаммов. Первый уровень относится к стандартной дозировке, тогда как второй уровень относится к более высоким значениям МИК и требует повышенного воздействия антибиотика. Конечно, величина МПК будет влиять на вероятность фармакокинетических / фармакодинамических индексов, которые имеют решающее значение для эффективности терапии. Не следует забывать, что в некоторых случаях более высокие уровни МПК антибиотика, близкие к контрольным точкам, могут указывать на неэффективность терапии, хотя штамм может считаться чувствительным при стандартных дозах. Это может быть первым сигналом сопротивления лекарству. Такое явление было обнаружено, например, в Сальмонелла энтерика серовар Typhi (С. Тифи). Штаммы с МИК & # x02264 0,06 мг / л имели точечную мутацию, связанную с извилина ген, который в дальнейшем привел к развитию устойчивости этого штамма к фторхинолонам [42,45]. Связь между значением MIC чувствительного штамма и эффективностью лекарства также описана, когда ванкомицин используется в S. aureus инфекции. Согласно литературным данным [46] и руководящим принципам EUCAST [40], МИК 2 мг / л для ванкомицина несет риск неэффективности терапии, несмотря на то, что штамм классифицируется как чувствительный в соответствии с принятой контрольной точкой.

Почему имеет значение степень восприимчивости? Чем более чувствителен штамм к антибиотику, тем больше вероятность того, что его MIC ниже ECOFF, и, следовательно, у штамма не разовьется какая-либо субпопуляция, устойчивая к лекарствам, поэтому нет повышенного риска выживания бактерий во время лечения. Кроме того, высокая чувствительность штамма увеличивает шанс достижения терапевтической концентрации антибиотика и эффективного уничтожения патогена при использовании стандартной дозировки даже у пациентов со значительными изменениями фармакокинетических параметров. Знание степени чувствительности штаммов к различным антибиотикам, используемым в больнице, также может быть инструментом, используемым для управления антибиотиками [47,48,49,50]. Таким образом, антибиотики, значение МИК которых для большинства штаммов (МПК90), близкая к точке останова, может быть переведена на группу лекарств с ограниченным доступом к эмпирической терапии, если, конечно, нет других факторов в пользу использования такого антибиотика. Это может способствовать сокращению отбора штаммов, устойчивых к антибиотикам, хотя это должно быть подтверждено результатами исследований, которые трудно выполнить. Практически невозможно получить данные о распределении значений MIC антибиотиков в большинстве больниц, потому что фактические значения MIC (а не приблизительные значения MIC, предлагаемые автоматизированными системами, такими как VITEK или Phoenix), обычно не определяются, и если они , они выполняются только для некоторых антибиотиков. Таким образом, обычно отсутствуют кумулятивные данные о распределении значений МИК для доминирующих патогенов при конкретных инфекциях. Однако это не означает, что группа по контролю за применением антибиотиков не может внедрить, после консультации с микробиологической лабораторией, программу мониторинга степени чувствительности к определенным антибиотикам в данной больнице, особенно в тех отделениях, где, несмотря на чувствительность штамма к антибиотикам , терапевтические неудачи более распространены. Полученные данные могут быть использованы в качестве основы для оценки соответствия списка антибиотиков, предназначенных для эмпирической терапии, и принятых режимов дозирования степени чувствительности штаммов. Основываясь на таких совокупных данных, Kuti et al. ввели длительные инфузии меропенема и непрерывные инфузии цефепима в отделении интенсивной терапии для достижения эффективности с учетом высоких значений МПК этих антибиотиков [47]. Кроме того, установив значения MIC в диапазоне 1,5 & # x020132 мг / л для большинства штаммов MRSA, они позволили ввести линезолид в терапию, если трехдневная терапия высокими дозами ванкомицина не улучшила клинический результат пациента. Через 12 месяцев эта процедура способствовала снижению смертности с 21,6% до 8,5% и времени госпитализации с 23 до 10,5 дней [47]. Внедрение таких решений просто путем их передачи из других больниц без привязки к местной эпидемиологической ситуации неоправданно и не даст ожидаемых результатов.

Использование антибиотиков с низкими значениями МПК во время лечения инфекций может повысить эффективность терапии. Однако следует учитывать, что в некоторых случаях даже при правильном дозировании эрадикация патогена не достигается. У такого состояния могут быть различные причины, включая гетерогенную устойчивость к антибиотикам (гетерорезистентность), толерантность или устойчивость микроорганизмов в среде определенных антибиотиков. Каждое из этих явлений отличается от обычно описываемой устойчивости к антибиотикам. Типичная бактериальная резистентность проявляется во многих механизмах, происходящих из стабильной генетической мутации или в результате экспрессии приобретенных всей клеточной популяцией генов устойчивости. Гетерорезистентность означает устойчивость очень небольшой субпопуляции клеток, которая начинает быстро расти в присутствии антибиотика, в то время как уязвимая популяция погибает. Прекращение приема антибиотиков снижает репликацию устойчивой субпопуляции [51]. Обнаружение устойчивых клеток в тестах обычно невозможно из-за низкой частоты их встречаемости в популяции, что может привести к ошибочным выводам о чувствительности к антибиотикам. Иногда такая гетерогенная субпопуляция может наблюдаться в градиентных тестах как присутствие бактериальных колоний в зоне ингибирования роста. Обнаружение таких штаммов обычно требует анализа профиля популяции & # x02014, который обычно не проводится. Гетерорезистентность описана для бактерий, таких как S. aureus, Klebsiella claceae (ранее Enterobacter cloacee), Клебсиелла пневмонии, Кишечная палочка, P. aeruginosa, Accinetobacter spp., и многие антибиотики, особенно колистин, фосфомицин или даже карбапенемы. Сложное выявление гетерорезистентности к колистину, одному из последних активных антибиотиков против устойчивых грамотрицательных бактерий, привело к обновлению рекомендаций. Рекомендуется вводить правильно. Рекомендуется вводить правильно подобранную первую ударную дозу колистина и часто использовать ее в сочетании с другими антибиотиками [52]. Более того, Fernandez et. al. сообщили о 20 & # x0201324% штаммов с субпопуляцией, гетерорезистентной к имипенему и меропенему [53]. Это не только диагностическая проблема, но, прежде всего, тяжелое клиническое состояние, которое вызывает до 10% неудач в лечении, несмотря на восприимчивость штаммов in vitro [51]. Другое явление - толерантность, означающая выживание всей популяции штамма в присутствии высокой концентрации антибиотика, несмотря на отсутствие клеток, устойчивых к антибиотику. Бактерии с такой толерантностью не растут и не делятся, но остаются жизнеспособными. Толерантность может проистекать из генотипа и быть связана с мутацией, которая позволяет бактериям избегать бактерицидной активности антибиотика. Это также может иметь фенотипический характер, когда задержка или задержка роста является результатом плохих условий питания. Переносимость распространяется только на бактерицидные антибиотики. Его бактерицидная активность снижается или исчезает при сохранении бактериостатических свойств. Переносимые бактерии и нетолерантные антибиотики могут иметь одинаковую МПК. Считается, что штамм демонстрирует толерантность, если антибиотик в концентрации, в 32 раза превышающей МИК, не способствует снижению на 99,9% количества бактерий, используемых в тесте (минимальная бактерицидная концентрация MBL / MIC & # x0003e 32 мг / л) [51,54]. Персистенция - это еще один бактериальный механизм, который может способствовать неэффективной терапии, несмотря на очевидную чувствительность к штаммам. Выживание касается только небольшой бактериальной субпопуляции (1%) и основано на присутствии временно неактивных или очень медленно делящихся клеток [51,54]. Эти три явления, описанные выше, очень трудно обнаружить и могут быть объяснением неэффективности лечения. Следовательно, выживание бактериальной популяции, несмотря на присутствие антибиотиков, может способствовать распространению механизмов устойчивости.

Считается, что значение МПК имеет наибольшее значение для оптимизации таргетной антибактериальной терапии. Однако для этой цели его необходимо анализировать вместе с фармакокинетическими (PK) параметрами, которые описывают судьбу лекарственного средства в организме-хозяине. Наиболее важными параметрами ПК являются: объем распределения (Vd), период полувыведения (t1/2), клиренс (CL), максимальная концентрация (Cmax), минимальная концентрация (Cmin) и площадь под кривой (AUC). Значение этих параметров зависит от многих факторов, таких как вес или возраст пациента, а также от степени дисфункции органов, поступления жидкости, но также варьируется в разных группах пациентов. Кроме того, параметры ПК меняются со временем. В случае штаммов, устойчивых к антибиотикам, определение механизма устойчивости бактерий может иметь дополнительное влияние на значимость значения МИК. Эта тема особенно обсуждается в случае грамотрицательных бактерий, продуцирующих карбапенемазы. Широко известно, что карбапенемазы могут обладать различным спектром и силой гидролитической активности против определенных бета-лактамов, включая карбапенемы. Согласно данным EUCAST и CLSI, обнаружение механизма устойчивости не исключает возможности использования карбапенемов для лечения инфекций, вызванных бактериями, продуцирующими карбапенемазы. Независимо от типа продуцируемых карбапенемаз или бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), клиническая интерпретация и классификация штамма S, I или R должны основываться на полученном значении МИК. В настоящее время меропенем считается наиболее важным карбапенемом, активным в отношении грамотрицательных Enterobacterales. Он включен в список антибиотиков, рекомендуемых для лечения инфекций, вызванных штаммами CPE, особенно когда штамм определяется как S (MIC & # x02264 2 мг / л, EUCAST BP)). Обычно выявление полной чувствительности указывает на эффективную терапию с использованием стандартных доз лекарственного средства, но в этом случае из-за выявления продукции карбапенемазы следует применять меропенем в высоких дозах, то есть по 2 г каждые 8 ​​ч в виде длительных инфузий. В диапазоне значений 2 мг / л & # x0003c MIC & # x02264 8 мг / л (чувствительный (I), повышенное воздействие, согласно EUCAST v.11.0) меропенем следует использовать не только в высоких дозах, но и в течение длительного времени. настой, но дополнительно в сочетании с такими антибиотиками, как колистин, тигециклин или амикацин, в зависимости от восприимчивости возбудителя. Если значение МИК не превышает 32 мг / л, также допускается применение меропенема в случае устойчивости к карбапенему [55]. При значениях МИК 8 & # x0003c & # x02264 32 мг / л необходимо не только применять высокие дозы, но и комбинировать их как минимум с двумя другими антибиотиками [56]. Было показано, что комбинированная терапия с меропенемом способствовала увеличению выживаемости пациентов, особенно с МПК 8 мг / л (16/19 пациентов с критическими инфекциями). Следует отметить, что в отношении штаммов KPC (+) следует использовать новые антибиотики с активностью против специфической карбапенемазы, такие как цефтазидим с авибактамом или меропенем с варбобактамом. Самый сложный выбор антибиотиков - это выявление общей лекарственной устойчивости. Это явление чаще всего наблюдается у штаммов NDM (+), которые приобретают другие механизмы устойчивости. В этом случае единственное решение - комбинированная терапия минимум тремя препаратами. Имеет ли значение в таком случае МПК антибиотиков? Авторы Международного консенсусного руководства по оптимальному использованию полимиксинов от 2019 года [52] предлагают выбирать препараты с самой низкой степенью устойчивости, где значение МИК наиболее близко к контрольным точкам. Поэтому даже в экстремальных ситуациях значение MIC может быть важным, хотя нет никаких доказательств эффективности такой процедуры.

Количественная взаимосвязь между МПК и ФК определяется фармакокинетическими / фармакодинамическими показателями ПК / ФД [57,58,59,60,61,62,63,64]. Клиническая эффективность различных групп антибиотиков зависит от одного из трех различных ФК / ФД:


БУДУЩИЕ НАПРАВЛЕНИЯ

В этом обзоре мы определили критерии для эффективного устройства, способного выполнять высокопроизводительное тестирование на месте для обнаружения антибиотиков в окружающей среде. Оптимальное устройство было бы высокочувствительным, способным к мультиплексированию и обнаружению соединений из сложных матриц, и потребовало бы минимального оборудования, электроэнергии, времени на процедуру и технического обучения пользователя. Кроме того, это было бы рентабельно, имело бы увеличенный срок хранения в различных условиях окружающей среды и соответствовало бы стандартам биобезопасности. Как обсуждалось в этом обзоре, в настоящее время существует множество чувствительных методов обнаружения и количественного определения антибиотиков, однако ни один из них в настоящее время не удовлетворяет всем этим критериям. Несмотря на то, что остаются значительные препятствия в адаптации любого из существующих устройств для использования на переднем крае, внедрение на месте в полевых условиях, некоторые из них действительно выглядят многообещающими. Возможно, наиболее удобным решением с точки зрения рентабельности, срока годности и удобства использования в полевых условиях является подход на основе бактериального промотора с использованием полоски или индикаторной полоски. Был разработан широкий спектр решений для определения антибиотиков в виде тест-полосок, охватывающих диапазон чувствительности и способности количественной оценки (Link, Weber and Fussenegger 2007 Fantino, Barras and Denizot 2009 Gomes, Goreti and Sales 2015 Han и другие. 2016 Дуйен и другие. 2017 Ван и другие. 2017а). Что касается выходных данных устройства, колориметрический анализ обеспечил бы удобные для пользователя, легко читаемые выходные данные, не требующие дорогостоящего оборудования для обнаружения или анализа.

Методика Link, Weber и Fussenegger (2007) включает многие из этих критериев готовности к работе. Интегрируя бесклеточную индуцибельную промоторную систему с репортерным механизмом на основе антител, этот подход с бесклеточной тест-полоской показал высокую чувствительность, обнаруживая ряд классов антибиотиков в концентрациях 2-40 нг / мл. Индивидуальные индикаторные полоски были разработаны для специфического распознавания различных антибиотиков без каких-либо признаков значительного перекрестного взаимодействия между целями. Наконец, срок хранения этих масляных щупов составляет до 6 недель при комнатной температуре. Необходимость в методике, похожей на индикаторную полоску, которую легко использовать на месте и которая обеспечивает относительно быстрый визуальный результат, хорошо обоснована в соответствующей литературе, как и в литературе Link et al. неоднократно цитировал модель такой техники (Адриан и другие. 2012 Чафер-Перикас, Макиейра и Пучадес 2010 Чен и другие. 2012 Цзян и другие. 2013 Динсер и другие. 2017 Камакоти и другие. 2018). Метод с помощью индикаторной полоски сравнивался с другими биосенсорными анализами и был отмечен за его удобство использования и чувствительность для обнаружения антибиотиков в образцах пищевых продуктов (Cháfer-Pericás, Maquieira and Puchades 2010). В недавнем обзоре будущих направлений биочувствительности и персонализированной лекарственной терапии был определен метод полосковых индикаторов как модель, демонстрирующая низкую стоимость и портативность конструкции биосенсора (Dincer и другие. 2017).

Однако, несмотря на обещание, остаются серьезные проблемы, препятствующие его внедрению в полевых условиях. По сравнению с другими методами обнаружения антибиотиков, метод полоски критиковался за недостаточную селективность (Kim и другие. 2010 Hou и другие. 2013). Хотя тест-полоска может различать три класса антибиотиков, тетрациклины, макролиды и стрептограмины, ему не хватает дополнительной специфичности из-за структурного сходства молекул антибиотиков в этих классах (Link, Weber and Fussenegger 2007). Следовательно, чтобы различать подклассы антибиотиков, предпочтителен анализ с более высокой специфичностью, такой как аптасенсор. Тест-полоска также подвергалась критике за длительность необходимого времени инкубации, часто требующего до 1 часа (Link, Weber and Fussenegger 2007 Cháfer-Pericás, Maquieira and Puchades 2010).

Тем не менее, усовершенствования тестовой полоски, разработанные Link et al. уже опубликованы (Kling и другие. 2016 Динсер и другие. 2016). Механизм обнаружения с помощью щупа был адаптирован к микрожидкостной платформе, чтобы обеспечить возможность множественного обнаружения на миниатюрном устройстве. Кроме того, выходной сигнал был изменен для получения электрохимического, а не колориметрического сигнала, что позволило получить более точный количественный выход. Было показано, что этот биосенсор имеет надежный срок хранения до 3 месяцев и быстрое время выпуска 15 минут (Kling и другие. 2016). Несмотря на то, что он сохраняет ограничения по специфичности и был протестирован только с использованием сыворотки человека с добавками, он предлагает дополнительные преимущества в виде более быстрого времени протокола и возможности мультиплексирования. В конечном итоге, в качестве метода первичной оценки на месте более широкое выявление и идентификация классов антибиотиков было сочтено достаточным (Cháfer-Pericás, Maquieira and Puchades 2010 Aga и другие. 2016 Клинг и другие. 2016). Более того, дополнительный скрининг природных промоторов и возможность создания синтетических промоторов имеет огромный потенциал для решения проблем специфичности (Goh и другие. 2002 Хаттер и другие. 2004 Mascher и другие. 2004 Городской и другие. 2007 Ягур-Кролл, Билич и Белкин 2010 Старонь, Финкейзен и Машер 2011 Меламед и другие. 2012 Ван, Тан и Ян 2017).


Молекулярные механизмы устойчивости

Бактерии генетически закодированы для использования внутренних или приобретенных механизмов устойчивости для борьбы с противомикробными агентами. Внутреннюю резистентность также можно увидеть при сравнении уровней клинической восприимчивости двух разных видов к обычному лекарству. Например, пенициллин G может обладать большей аффинностью связывания с пенициллин-связывающими белками Streptococcus agalactiae чем для тех из Enterococcus faecalis.

Мы знаем, что устойчивость к метициллину S. aureus (MRSA) в первую очередь происходит из-за изменений, происходящих в PBP, который представляет собой белок, с которым ß-лактамные антибиотики связываются и инактивируют, подавляя синтез клеточной стенки. Это изменение вызвано экспрессией определенного гена mecA в некоторых штаммах S. aureus которые возникают после применения пенициллина и других противомикробных препаратов в анамнезе. Экспрессия гена mecA приводит к образованию альтернативного PBP (PBP2a), который имеет низкое сродство к большинству ß-лактамных антибиотиков, что позволяет этим штаммам реплицироваться в присутствии метициллина и родственных антибиотиков.

Некоторая устойчивость к противомикробным препаратам вызвана множественными изменениями в геноме бактерий. Например, устойчивость к изониазиду Микобактерии туберкулеза возникает в результате изменений в следующих генах: ген katG, который кодирует каталазу, ген inhA, который является мишенью для изониазида, соседние гены oxyR и aphC и их межгенная область.

Сопротивление биологической и клинической устойчивости

Биологическая устойчивость относится к изменениям, в результате которых организм становится менее восприимчивым к определенному противомикробному агенту. Когда чувствительность к противомикробным препаратам утрачена до такой степени, что лекарство перестает быть эффективным для клинического применения, считается, что организм достиг клинической устойчивости. Важно отметить, что биологическая устойчивость и клиническая устойчивость не обязательно совпадают. С точки зрения клинических лабораторий и общественного здравоохранения, биологическое развитие устойчивости к противомикробным препаратам - это непрерывный процесс, в то время как клиническая устойчивость зависит от современных лабораторных методов и установленных пороговых значений. Наша неспособность надежно обнаружить биологическую резистентность с помощью текущих лабораторных процедур и критериев не должна восприниматься как свидетельство того, что это не происходит (Forbes, et al., 1998).

Внутреннее сопротивление

Внутренняя резистентность - это врожденная способность бактериального вида противостоять активности конкретного противомикробного агента за счет присущих ему структурных или функциональных характеристик, которые делают возможной толерантность к определенному лекарственному средству или классу противомикробных средств. Это также можно назвать «нечувствительностью», поскольку это происходит у организмов, которые никогда не были восприимчивы к этому конкретному препарату.

Такая природная нечувствительность может быть связана с:

  • отсутствие сродства препарата к бактериальной мишени.
  • недоступность препарата в бактериальную клетку.
  • экструзия препарата активными экспортерами, кодируемыми хромосомами.
  • врожденная выработка ферментов, инактивирующих препарат.

Примеры внутреннего сопротивления и их соответствующие механизмы

(Из Forbes, et al., 1998, Giguere, et al., 2006).

Невозможность анаэробного восстановления метронидазола до его активной формы.

Биопленки, которые представляют собой скопление бактериальных клеток, прочно прикрепленных к поверхности посредством усиков или нитей, служат примером нескольких форм внутренней устойчивости.

  • Они окружены слизистой защитной оболочкой из ДНК, белков и полисахаридов, которая создает барьер для проникновения антибиотиков.
  • Электрические заряды на поверхности слизи препятствуют проникновению некоторых противомикробных препаратов.
  • Сложная трехмерная структура биопленок содержит транспортные белки для поглощения питательных веществ и удаления отходов, последние из которых могут выкачивать лекарства из клеток.
  • Биопленки обладают способностью снижать концентрацию некоторых противомикробных препаратов, достигающих бактериальных клеток, что делает их менее эффективными в уничтожении бактерий.
  • Поскольку клетки глубоко внутри биопленки получают меньше кислорода и питательных веществ, они растут относительно медленно и, таким образом, менее восприимчивы к действию антимикробных препаратов.

Некоторые примеры бактерий, способных образовывать биопленки, поражающие животных, включают: Neisseria виды как зубной налет на зубах, Промежуточный стафилококк на ортопедические имплантаты и кардиостимуляторы, а также Сальмонелла виды на поверхностях окружающей среды.

Клинические последствия: внутреннее сопротивление.

Знание внутренней резистентности важно в клинической практике, чтобы избежать неадекватных и неэффективных методов лечения. Для бактериальных патогенов, которые по своей природе нечувствительны к большому количеству классов противомикробных препаратов, таких как Микобактерии туберкулеза а также Синегнойная палочка, это соображение может ограничить диапазон вариантов лечения и, таким образом, увеличить риск приобретения резистентности.

Приобретенное сопротивление

Считается, что приобретенная устойчивость возникает, когда конкретный микроорганизм приобретает способность противостоять активности конкретного противомикробного агента, к которому он ранее был чувствителен. Это может быть результатом мутации генов, участвующих в нормальных физиологических процессах и клеточных структурах, приобретения чужеродных генов устойчивости или сочетания этих двух механизмов. Успешное изменение и / или обмен гена может включать мутацию или горизонтальный перенос гена путем трансформации, трансдукции или конъюгации.

В отличие от внутренней устойчивости, признаки, связанные с приобретенной устойчивостью, обнаруживаются только у некоторых штаммов или субпопуляций бактериального вида и требуют лабораторных методов для обнаружения. Эти же методы используются для мониторинга показателей приобретенной устойчивости как средства борьбы с появлением и распространением признаков приобретенной устойчивости у патогенных и непатогенных видов бактерий.

Механизм приобретенной устойчивости через изменение или обмен генов

Антибиотики оказывают избирательное давление на популяции бактерий, убивая восприимчивые бактерии, позволяя штаммам с устойчивостью к антибиотикам выживать и размножаться. Эти черты вертикально передаются впоследствии воспроизводимым клеткам и становятся источниками сопротивления. Поскольку признаки устойчивости не обязательно устраняются или обращаются вспять, устойчивость к различным антибиотикам может накапливаться с течением времени. Это может привести к появлению штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, которые труднее устранить из-за ограниченных возможностей эффективного лечения.

В этом разделе мы обсудим приобретенное сопротивление в отношении:

  • Мутации
  • Горизонтальный перенос генов
  • Обнаружение устойчивости к противомикробным препаратам
    Лабораторные подходы и стратегии
  • Методы испытаний для определения устойчивости к противомикробным препаратам
  • Примеры методов тестирования чувствительности к антибиотикам

Мутации

Изображение: нормальный бактериальный геном приводит к нормальной клеточной структуре и функции, тогда как мутация в бактериальном геноме приводит к изменению клеточной структуры и функции и, в конечном итоге, к изменению восприимчивости.

Мутация - это спонтанное изменение последовательности ДНК, которое может привести к изменению признака, для которого она закодирована. Любое изменение одной пары оснований может привести к соответствующему изменению в одной или нескольких соответствующих аминокислотах, которые затем могут изменить фермент или структуру клетки и, следовательно, повлиять на аффинность или активность связанных противомикробных препаратов.

В прокариотических геномах мутации часто возникают из-за изменений оснований, вызванных экзогенными агентами, ошибок ДНК-полимеразы, делеций, вставок и дупликаций (Gillespie, 2002).

Горизонтальный перенос генов

Горизонтальный перенос генов или процесс обмена генетическим материалом между соседними бактериями - еще один способ приобретения устойчивости. Многие гены устойчивости к антибиотикам переносятся на плазмидах, транспозонах или интегронах, которые действуют как векторы для передачи генов другим подобным видам бактерий. Горизонтальный перенос генов может происходить с помощью трех основных механизмов: трансформации, трансдукции или конъюгации.

Механизмы обмена генов: конъюгация

Обмен генов посредством конъюгации с переносом плазмиды

Трансформация включает процесс поглощения бактериями коротких фрагментов ДНК. Трансдукция включает перенос ДНК от одной бактерии к другой через бактериофаги. Конъюгация включает перенос ДНК через половое сечение и требует межклеточного контакта. Посмотрите небольшой видеоролик о горизонтальном переносе генов.

Вы знали? Конъюгация была впервые описана в 1946 году Ледербергом и Татумом на основании исследований, показывающих, что кишечные бактерии Кишечная палочка использовать процесс, напоминающий пол, для обмена кольцевыми внехромосомными элементами, теперь известными как плазмиды. (Торренс и Исааксон, 2003 г.)

Примеры приобретенной устойчивости в результате мутаций и горизонтального переноса генов, включая наблюдаемую устойчивость и задействованный механизм.

Приобретенное сопротивление через Сопротивление наблюдается Задействованный механизм
Мутации Микобактерии туберкулеза устойчивость к рифамицинам Точечные мутации в области связывания рифампицина rpoB
Устойчивость многих клинических изолятов к фторхинолонам Преимущественно мутация области, определяющей устойчивость к хинолонам (QRDR) GyrA и ParC / GrlA
E. coli, Hemophilius influenzae устойчивость к триметоприму Мутации в хромосомном гене, определяющем дигидрофолатредуктазу
Горизонтальный перенос генов Устойчивость золотистого стафилококка к метициллину (MRSA) Путем приобретения генов mecA, которые находятся на мобильном генетическом элементе, называемом «хромосома стафилококковой кассеты» (SCCmec), который кодирует пенициллин-связывающие белки (PBP), которые не чувствительны к ингибированию ß-лактама.
Устойчивость многих патогенных бактерий к сульфаниламидам Опосредовано горизонтальным переносом чужеродных генов folP или их частей.
Enterococcus faecium а также E. faecalis устойчивость к ванкомицину Посредством приобретения одного из двух связанных кластеров генов VanA и VanB, которые кодируют ферменты, которые модифицируют предшественник пептидогликана, снижая сродство к ванкомицину.

Обнаружение устойчивости к противомикробным препаратам

Исторически сложилось так, что практикующие ветеринары прописывали антибиотики в зависимости от предполагаемого механизма действия, спектра активности и клинического опыта. С появлением и распространением устойчивости к противомикробным препаратам лечение бактериальных инфекций становится все труднее и уже не так просто, как много лет назад. Теперь практикующим врачам необходимо учитывать, что обрабатываемые организмы могут быть устойчивыми к некоторым или ко всем антимикробным препаратам. Эти соображения требуют стандартной процедуры тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам.

Методы тестирования чувствительности к противомикробным препаратам: in vitro процедуры, используемые для выявления устойчивости к противомикробным препаратам и чувствительности отдельных бактериальных изолятов к широкому спектру вариантов противомикробной терапии. Эти же методы можно использовать для мониторинга появления и распространения устойчивых микроорганизмов в популяции.

Клинические контрольные точки - это пороговые значения, установленные для каждой комбинации патоген-антибиотик-хозяин, указывающие, при каком уровне антибиотика изолят является чувствительным, промежуточным или устойчивым к стандартным схемам лечения, рекомендованным производителем. Критерии интерпретации для них основаны на обширных исследованиях, которые коррелируют лабораторные данные о резистентности с достижимыми уровнями в сыворотке для каждого противомикробного агента и историей успешных и неудачных терапевтических результатов. Хотя ветеринарные лаборатории первоначально основывали свои интерпретации на стандартах, установленных с использованием патогенов человека, к началу 1980-х годов стало очевидно, что такой подход не позволяет надежно прогнозировать клинические исходы при применении в ветеринарной практике. Впоследствии были созданы группы для разработки специальных ветеринарных стандартов.

Стандарты публикации организаций

  • США: Институт клинических и лабораторных стандартов (CLSI, ранее NCCLS).
  • Европейский Союз: Европейский комитет по тестированию на чувствительность к противомикробным препаратам (EUCAST).
  • Европейский Союз: Международное бюро пищевых продуктов (МЭБ).
  • Соединенное Королевство: Британское общество антимикробной химиотерапии.
  • Германия: Deutsches Institut für Normung.
  • Франция: Société Française de Microbiologie.
  • Швеция: Шведская справочная группа по антибиотикам.
  • Австралия: дисковый диффузионный метод CDS.

МЕТОДЫ

Микробиологические анализы

Классическим методом обнаружения присутствия антибиотиков является использование микробиологических анализов, в которых используются виды бактерий, чувствительных к антибиотикам, для определения наличия определенных антибиотиков в данном образце и, с ограниченной чувствительностью, их концентрации. С 1950-х годов микробиологические анализы выявляли аберрации в известных моделях роста, чтобы обнаружить присутствие антибиотиков в данном образце (Kersey и другие. 1954). Современные коммерческие анализы полагаются на один из двух методов определения наличия антибиотика в образце. Дисковая диффузия использует диски, покрытые исследуемым образцом, которые помещают на чашки, на которых растут бактерии. Наличие ореола очищенного роста вокруг диска указывает на то, что бактерии были убиты антибиотиком в диске. Этот тест может идентифицировать определенные антибиотики или классы антибиотиков в зависимости от вида используемых бактерий и был оптимизирован для использования в образцах молока с пределом обнаружения (LOD) для β-лактамов от 30 до 80 нг / мл (Кукурова и Хозова, 2007 г.) Piech и другие. 2016). Во втором методе используются определенные бактерии с известной чувствительностью к антибиотикам, разработанные для получения колориметрического результата. Эти реакции изменения цвета могут быть количественно проанализированы с помощью спектрофотометрии для определения концентрации антибиотика, присутствующего в образце, и могут быть чувствительны до 1 нг / мл, но требуют стерильной техники и лабораторного оборудования для совместной инкубации образца с бактериями (Le Breton , Savoy-Perroud и Diserens 2007 Калунке и другие. 2018).

В качестве стандартной методики коммерчески доступные микробиологические анализы были оптимизированы для тестирования образцов продуктов питания и напитков, в частности, образцов молока и сыворотки, чтобы определить, присутствуют ли физиологически релевантные уровни антибиотиков (Kukurova and Hozova 2007 Le Breton, Savoy-Perroud and Diserens 2007 Beltrán и другие. 2015 Калунке и другие. 2018). Другие микробиологические методы имеют качественные или полуколичественные результаты и обеспечивают либо бинарный ответ, либо диапазон концентраций (Кукурова и другие. 2007 Ле Бретон, Савой-Перро и Дизерен 2007 Калунке и другие. 2018). Эти методы могут работать в сложных матрицах, но из-за их выходных данных определение точных концентраций будет затруднительно. Многие микробиологические анализы сосредоточены исключительно на семействе β-лактамных антибиотиков, обычно используемых в ветеринарии, и имеют низкую чувствительность за пределами этой категории; обзор коммерческих тестов показал, что, хотя они могут обнаруживать концентрации до 4 нг / мл внутри β -lactam, тесты ограничены 100 нг / мл или более в других семьях (обзор в Beltrán и другие. 2015).

Для некоторых микробиологических анализов потребность в лабораторных условиях снижается за счет микрофлюидики и бумажных методов, которые надежно работают с нестерильными образцами и в полевых условиях (Sun и другие. 2011 Deiss и другие. 2014). Микрофлюидный анализ основан на изменении морфологии бактерий, когда в образце присутствуют сублетальные, но не субингибирующие концентрации антибиотиков (Sun и другие. 2011). Этот метод требует некоторого опыта для реализации, но имеет многообещающую адаптацию в полевых условиях. Капельная микрофлюидика проявляет большую чувствительность, но современные методы сосредоточены на выявлении наличия генов устойчивости к антибиотикам, а не на измерении концентраций антибиотиков (Kaminski, Scheler and Garstecki, 2016).

Таким образом, микробиологические анализы обычно требуют значительного оборудования и стерильного лабораторного оборудования и часто оптимизированы для конкретных антибиотиков, что делает их относительно непригодными для полевого анализа на месте, хотя развитие микрофлюидики или бумажных методов расширило их диапазон. анализы. Проблемой для полевого использования бумажных микробиологических анализов является потребность в живых или лиофилизированных бактериях, которые могут быть восстановлены на месте без заражения. Из-за этих проблем, а также требований к переносимости, инкубации и стерильности микробиологические анализы в настоящее время не являются оптимальными для полевых испытаний на месте.

Физико-химические анализы

В отличие от микробиологических анализов, которые ограничены чувствительностью бактерий к антибиотикам, физические и химические анализы нацелены на конкретные свойства молекулы, такие как размер, заряд, характеристики связывания или реактивные свойства, для идентификации антибиотиков в разнообразном образце. Физическая очистка влечет за собой отделение антибиотика от других примесей в образце, что позволяет выделить желаемый элемент путем повторного фракционирования. Конечная фракция для очистки антибиотиком анализируется с помощью спектрофотометрии и имеет LOD приблизительно 25 нг / мл (обзор González de la Huebra and Vincent 2005).

Подготовленный образец может быть дополнительно проанализирован с помощью спектрометрии - возможности, требующей большого количества оборудования, чувствительной к разрешению до одной молекулы. Тандемная масс-спектрометрия анализирует образцы на интересующие молекулы, включая антибиотики, с LOD ниже 0,1 нг / мл (Zhang и другие. 2013). Жидкостная хроматография / масс-спектрометрия (ЖХ / МС) была адаптирована для количественного определения концентраций антибиотиков в образцах молока, сыворотки, мяса, почвы и воды (Luo и другие. 2010 г. и другие. 2011 Чжан и другие. 2013 Байен и другие. 2014 Костич, Батт и Лазорчак 2014 Тан и другие. 2015 Jha и другие. 2017). ЖХ / МС также применялся для анализа проб с месторождений, где матричные эффекты были определены как незначительные после очистки (Luo и другие. 2010 г. и другие. 2011 Чжан и другие. 2013 Костич, Батт и Лазорчак 2014 Тан и другие. 2015 Jha и другие. 2017). Некоторые часто используемые методы борьбы с осложнениями почвенных матриц включают изотопное разбавление, добавление стандарта, ручную калибровку или замену колонки (Aga и другие. 2005 Байен и другие. 2014). Физические методы были успешно оптимизированы для проб окружающей среды, что указывает на то, что они не требуют стерильных исходных материалов и являются отличным инструментом для лабораторного анализа (Луо и другие. 2010 Байен и другие. 2014 Чен и Чжоу 2014 Костич, Батт и Лазорчак 2014 Бего и другие. 2017). Однако и очистка, и спектрометрия требуют значительного опыта пользователя и вспомогательной инфраструктуры и включают сложные процедуры или чувствительные технологии, которые нелегко транспортировать на полевые объекты, этот метод лучше всего приспособлен для обработки полевых проб в полностью оборудованных лабораториях (Soprani и другие. 2016 Пан и Чу 2017).

Альтернативно, поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия (SERS) позволяет использовать электроды с трафаретной печатью для спектроскопического анализа. Этот метод предлагает высокую чувствительность и портативное быстрое обнаружение, которое можно легко адаптировать к полевым работам (Li и другие. 2014). При продолжительности процедуры менее 10 минут SERS использовался для определения концентраций антибиотиков в образцах воды (Li и другие. 2013). Однако SERS также требует очистки образца для обогащения антибиотиков относительно других загрязнителей или растворенных веществ в образце, что увеличивает технические знания, необходимые для тестирования на месте. Устранение предварительной обработки образца и автоматизация анализа выходных данных может оптимизировать SERS для использования на месте.

В готовых к эксплуатации химических анализах используются микрофлюидные или бумажные подходы, которые делают их портативными и масштабируемыми. Одна группа разработала микрожидкостную систему, которая обеспечивает химическое взаимодействие между аминогликозидными антибиотиками и ионами меди, с измеряемым хемилюминесцентным выходом, этот встроенный на кристалле метод является портативным и имеет LOD менее 1 нг / мл (Sierra-Rodero, Fernández-Romero и Gómez-Hens 2012). Хотя эти функции многообещающи для использования на месте, этот метод требует некоторого опыта пользователя для микроинъекции образца в чип. Химические растворы на бумажной основе, в которых химические модификации бумаги вызывают колориметрические характеристики в ответ на присутствие антибиотиков, также перспективны для полевых исследований и требуют меньшего количества технических знаний. Gomes, Goreti and Sales (2015) продемонстрировали, что путем добавления слоя амина, реагирующего на ионы металлов, в среду на бумажной основе окситетрациклины могут быть обнаружены в воде с уровнем детализации около 30 нг / мл. Однако бумажные методы в настоящее время могут обнаруживать только несколько заранее определенных интересующих соединений. Дальнейшие исследования должны расширить возможности бумажных методов для выявления более широкого диапазона соединений в одном тесте.

Иммуноанализы

Иммуноанализы обеспечивают высокочувствительное специфическое обнаружение антибиотиков в сложных жидких или обработанных твердых образцах, полагаясь на специфичность взаимодействий между антителами и интересующей молекулой (обзор в Ahmed и другие. 2017). Иммуноанализы обычно являются колориметрическими на выходе (Aga и другие. 2005 Чафер-Перикас, Макиейра и Пушадес 2010 Грэм и другие. 2011), но у некоторых есть флуоресцентные или хемилюминесцентные выходы (Meyer и другие. 2016), в зависимости от используемой репортерной молекулы.

Иммуноанализы для обнаружения антибиотиков, в частности ELISA, были адаптированы для образцов почвы, продуктов питания и воды (Aga и другие. 2005 Чафер-Перикас, Макиейра и Пушадес 2010 Грэм и другие. 2011 Гарг и другие. 2016 Мейер и другие. 2016). Кроме того, коммерчески доступные ELISA, разработанные для образцов пищевых продуктов, использовались в полевых исследованиях по мониторингу сточных вод из рек и образцов почвы, взятых с экспериментальных участков, обработанных навозом (Aga и другие. 2005 и Грэм и другие. 2011). Из-за перекрестной реактивности антител, выявляющих изомеры и продукты разложения, ELISA может завышать концентрации и не показывать снижения с течением времени (Aga и другие. 2005). Иммуноанализы могут обеспечить чувствительное обнаружение антибиотиков в образцах с использованием вторичных антител для усиления сигнала и обычно имеют LOD ниже 1 нг / мл (обзор в Cháfer-Pericás, Maquieira and Puchades 2010). Однако добавление вторичных антител увеличивает стоимость образца, ограничивая использование иммуноанализа как недорогого, готового к применению метода. Другой проблемой, ограничивающей использование иммуноанализов для анализа на месте, является их зависимость от спектрофотометров для количественной оценки результатов испытаний. Эти анализы дополнительно требуют умеренного уровня научных знаний для выполнения процедуры, что исключает участие неподготовленных пользователей в процессе сбора данных.

Использование антител обычно ограничивает один иммунологический анализ одним или относительно небольшим количеством антибиотиков в зависимости от специфичности антител, используемых в анализе (Graham и другие. 2011). Перекрестная реактивность антител снижает специфичность теста, поскольку антитела могут реагировать с небиологически активными компонентами путей разложения антибиотиков (Aga и другие. 2005). Измерения концентрации на основе перекрестно-реактивного иммуноанализа могут переоценить уровень антибиотика, присутствующего в данном образце, и затруднить попытки понять устойчивость к антибиотикам в экологическом контексте.

Несмотря на эти ограничения, недавние разработки миниатюрных, удобных для пользователя иммуноанализов предлагают некоторый потенциал для адаптации этого метода в полевых условиях. Был разработан широкий спектр методов, которые адаптируют иммуноанализы в мультиплексный формат, тем самым повышая эффективность и высокую пропускную способность обнаружения за счет локализации различных антител в отдельных частях чипа или полоски (Jiang и другие. Песня 2013 и другие. 2015 Хан и другие. 2016 Ван и другие. 2017а). Одна группа создала регенерируемый хемилюминесцентный микрочип, который позволяет обнаруживать до 13 антибиотиков одновременно в образцах молока, и стремится масштабировать продукт для недорогого использования в полевых условиях (Мейер и другие. 2016). Другие новые иммуноанализы еще больше улучшили удобство использования, предлагая мультиплексный анализ с поддающимся количественной оценке колориметрическим выходом. В 2013 году Цзян и его коллеги разработали «двухколориметрический» анализ, в котором использовались две разные системы ферментных субстратов для одновременного обнаружения 13 фторхинолоновых и 22 сульфонамидных антибиотиков (Jiang и другие. 2013). Совсем недавно Ханом был создан мультиплексный анализ. и другие. (2016), которые позволили одновременно обнаруживать три разных антибиотика на тест-полоске, этот метод предлагает несколько функций, которые повышают удобство использования, включая количественный колориметрический результат и время процедуры 10 минут без предварительной обработки устройства. В аналогичном устройстве, которое было специально разработано для высокопроизводительных измерений на месте, латексные шарики использовались для колориметрического вывода в мультиплексном тесте с одной полосой для трех классов антибиотиков. При тестировании образцов молока с добавками этот метод продемонстрировал чувствительность 0,3–10 нг / мл с незначительным перекрестным влиянием между классами антибиотиков и продолжительностью процедуры 10 мин (Wang и другие. 2017а). Эти мультиплексные иммуноанализы, специально разработанные для высокопроизводительного детектирования на месте, являются многообещающими для использования в полевых условиях в первую очередь.

Аптасенсоры

Более поздний метод обнаружения антибиотиков использует датчики аптамеров (аптасенсоры). Аптамеры представляют собой олигонуклеотиды ДНК или РНК, которые могут связываться с высокой аффинностью со специфическими мишенями (Yang и другие. 2017). Аптасенсоры, разработанные для обнаружения антибиотиков, делятся на три категории: электрические, флуоресцентные и колориметрические.

Электрические аптасенсоры обычно иммобилизуют аптамер на поверхности электрода или наночастицы, так что введение целевой молекулы вызывает конформационное изменение аптамера. Это изменение освобождает зонд или подвергает электрод воздействию зонда окислительно-восстановительного потенциала. Abnous et al. разработали электрический аптасенсор для фторхинолонов, который является типичным для электродной техники: целевой аптамер был иммобилизован на золотом электроде. В отсутствие мишени одноцепочечные связывающие белки (SSB) связывались с аптамером и ингибировали доступ окислительно-восстановительного зонда к поверхности электрода. В присутствии мишени аптамер-специфическое связывание снижает аффинность связывания SSB, увеличивая доступ к окислительно-восстановительному зонду и вызывая обнаруживаемый сдвиг тока с чувствительностью 0,0871 нг / мл (Abnous и другие. 2017). В других электрических аптасенсорах используются электроды из других материалов (Li и другие. 2017 Ван и другие. 2018), комплементарная одноцепочечная ДНК для блокирования окислительно-восстановительного зонда (Danesh и другие. 2016 Тагдиси и другие. 2016) или различные зонды, такие как ионы или квантовые точки (Li и другие. 2016 Ян и другие. 2016), но достичь того же результата при сопоставимой чувствительности (Лю и другие. 2017а, б).

Другие электрические аптасенсоры используют наночастицы в качестве сигнального зонда (Chen и другие. 2017b) или для иммобилизации аптамера (Chen и другие. 2017а). Чен и другие. разработали аптасенсор, в котором аптамеры, специфичные для канамицина и хлорамфеникола, были иммобилизованы на амино-модифицированных магнитных шариках и комплементарно связаны с сигнальными зондами ДНК с наноразмерным металлоорганическим каркасом (NMOF), несущим определенный ион. Когда мишень была введена, она связывалась с аптамером, заменяя и высвобождая сигнальный зонд и создавая обнаруживаемый ток ионов в NMOF (Chen и другие. 2017b).

Флуоресцентные и колориметрические аптасенсоры используют разнообразные механизмы. Введение мишени вызывает конформационное изменение, которое может подвергнуть поверхность наночастиц воздействию изменяющего цвет реагента (Emrani и другие. 2016 Лаваи и другие. 2017). Lavaee et al. иммобилизовали комплементарную оцДНК на поверхности наночастиц золота, которые в отсутствие мишени образуют арки со специфическими для ципрофлоксацина аптамерами, блокируя поверхность наночастицы и ингибируя восстановление 4-нитрофенола и, следовательно, изменение цвета. В присутствии мишени поверхность обнажается, снижая уровень 4-нитрофенола и вызывая измеримое изменение поглощения (Lavaee и другие. 2017). Присутствие мишени также может разрушить комплементарный комплекс, высвобождая или гася флуорофор (Emrani и другие. 2016 Бабаи и другие. 2017 Хэ, Ли и Ху 2017 Ха и другие. 2017 Ву и другие. 2017 Чен и другие. 2017г). Чен и другие. использовали спаривание оснований Waston-Crick и Hoogsten для образования тройной спирали между двумя плечами, фланкирующими тетрациклин-специфический аптамер и зонд трансдукции сигнала (STP), который в присутствии мишени разбирает и высвобождает STP. Затем STP образует квадруплекс и связывается с тиофлавином T, генерируя флуоресцентный выход (Chen и другие. 2017г). Другие флуоресцентные и колориметрические аптасенсоры могут использовать петли шпильки, которые образуют квадруплекс в присутствии мишени (Cui и другие. 2018) или экзонуклеаза для усиления сигнала (He, Li and Hu, 2017 Wu и другие. 2017). Аптасенсоры также могут образовывать шпильки, которые затем можно обнаружить с помощью qRT-PCR (Duan и другие. 2017) или электрофорез на микрочипе (Wang и другие. 2017b).

Аптасенсоры на бумажной основе были разработаны, чтобы упростить транспортировку аптасенсоров. Zhang, Zuo and Ye (2015) представляют микрофлюидное устройство на бумажной основе, включающее аптамеры оцДНК для обнаружения аминогликозидных антибиотиков, с чувствительностью около 300 нг / мл, в то время как Sharma et al. (2017) разработали электрод с трафаретной печатью, который обнаруживает канамицин с чувствительностью 0,11 нг / мл. Аптасенсоры очень чувствительны и имеют предел детализации в диапазоне от микрограммов до нанограмм на литр. Более чувствительные аптасенсоры имеют тенденцию быть электрическими и могут иметь LOD 1,07 e - 5 нг / мл (Chen и другие. 2017a, b), который идеально подходит для обнаружения следовых количеств антибиотиков в полевых условиях. Кроме того, аптасенсоры имеют относительно короткие процедуры, от 30 минут до 2 часов, что полезно для взятия нескольких образцов в полевых условиях (Zhang, Zuo and Ye 2015 Li и другие. 2016 Ян и другие. 2017). Аптасенсоры, адаптированные для определения концентрации антибиотиков в образцах молока, сыворотки и воды, способны эффективно обнаруживать антибиотики в сложных матрицах (Hoa и другие. 2011).

Существенным ограничением применения аптасенсоров в этой области является то, что они, как правило, являются одноплексными и поэтому не могут одновременно идентифицировать несколько классов антибиотиков. Хотя описаны множественные аптасенсоры, большинство из них протестировали одновременное обнаружение до двух антибиотиков (Ян и другие. 2016 Чен и другие. 2017a, b Хуан и другие. 2018 Ли и другие. 2018 Чжоу и другие. 2018). В 2016 году Хао и его коллеги внедрили систему аптамеров кДНК с хемилюминесцентным выходом для одновременного обнаружения окситетрациклина, тетрациклина и канамицина с чувствительностью 0,05 нг / мл в образцах молока. Хотя этот метод был разработан для удобства использования и демонстрирует высокую чувствительность, хемилюминесцентный выход может быть ограничением для использования в полевых условиях из-за необходимости в оборудовании для обнаружения (Hao, Gu and Duan, 2016).

Аптасенсоры представляют собой высокочувствительный, относительно быстрый и надежный метод обнаружения, однако они имеют значительные ограничения в их способности одновременно тестировать широкий спектр антибиотиков. Кроме того, аптасенсоры в настоящее время требуют значительного количества реагентов и оборудования для обучения и обнаружения. Хотя существуют портативные модели спектрофотометров и электрохимических рабочих станций, их может быть трудно использовать в изолированных местах с ограниченными ресурсами. Аптасенсоры могут быть подходящим методом вторичного обнаружения для проверки результатов с более высокой селективностью и специфичностью, но они не идеальны для широко распространенного высокопроизводительного обнаружения. Однако разработка аптасенсоров без реагентов или без меток, которые позволили бы минимизировать обучение и потребовать меньше ресурсов, является многообещающим направлением для использования в полевых условиях (Yang и другие. 2017 Ван и другие. 2017b Чен и другие. 2017г).

Цельноклеточные биосенсоры

Другой метод обнаружения антибиотиков использует синтетическую биологию, чтобы задействовать внутренний механизм бактериальных клеток для определения локальной концентрации антибиотиков. Вместо того, чтобы просто отслеживать реакцию клетки на присутствие антибиотиков, бактериальные клетки можно генетически модифицировать, чтобы они предсказуемо реагировали на различные концентрации антибиотиков. Это может быть достигнуто путем встраивания сконструированных плазмидных конструкций, содержащих последовательности ДНК, чувствительные к антибиотикам, в бактериальные организмы-хозяева. Продукт известен как цельноклеточный биосенсор (Корпела и другие. 1998 Gui и другие. 2017 Чен и другие. 2017c). Эволюция эффективно подготовила бактерии к ответу на потенциальное повреждение, этот ответ часто представляет собой изменение экспрессии генов, вызванное бактериальными промоторами, вызванное присутствием небольшой молекулы, включая антибиотики (Goh и другие. 2002). Этот внутренний клеточный ответ на присутствие антибиотиков может быть обнаружен путем слияния чувствительного к антибиотику промотора с репортерной конструкцией, которая преобразует сигнал в визуальный ответ, обнаруживаемый пользователем (Chen и другие. 2017c).

Создание цельноклеточных бактериальных биосенсоров для обнаружения антибиотиков - не новая концепция. В 1998 году Корпела и его коллеги генетически модифицировали штамм кишечная палочка сочетая генетические элементы, реагирующие на тетрациклин, с опероном люциферазы, создавая биосенсор, который реагировал на тетрациклин биолюминесценцией (Korpela и другие. 1998). С тех пор были протестированы и улучшены десятки итераций аналогичных проектов. Выбор промотора, возможно, является наиболее важным аспектом конструкции биосенсора, поскольку этот выбор определяет специфичность, а также чувствительность сенсора (Gui и другие. 2017). Гох и его коллеги обнаружили, что после скрининга библиотеки из 6500 бактериальных промоторов, присущих Сальмонелла тифимуриумдо 5% этих промоторов демонстрировали изменение экспрессии в ответ на субингибирующие концентрации антибиотиков. Многие такие промоторы были хорошо охарактеризованы для множества видов бактерий, обеспечивая сотни потенциальных биосенсорных мишеней и бактериальных хозяев, кроме того, с помощью панели слияния промотор-репортер он позволяет классифицировать неизвестные антибиотики на основе реакции каждого промотора. (Goh и другие. 2002 Хаттер и другие. 2004 Mascher и другие. 2004 Городской и другие. 2007 Старонь, Финкейзен и Машер 2011 Меламед и другие. 2012).

Цельноклеточные бактериальные биосенсоры обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения. Бактериям требуется относительно немного и недорогие ресурсы, чтобы оставаться жизнеспособными, а их быстрое размножение делает легко достижимым тестирование с высокой пропускной способностью. Кроме того, бактериальные датчики предоставляют информацию о биодоступности субстратов, которая в контексте отслеживания развития устойчивости бактерий может предлагать более актуальный показатель, чем прямое измерение концентраций в образцах воды или почвы (Aga и другие. 2016 Gui и другие. 2017).

Биосенсоры адаптированы для образцов молока, воды, сыворотки и мяса (Link, Weber and Fussenegger 2007 Pikkemaat и другие. 2010 Рода и другие. 2011 Чжан, Цзо и Е 2015 Дуйен и другие. 2017 Чен и другие. 2017c Суарес и другие. 2009), а также были внедрены в полевые исследования для обнаружения антибиотиков (Chen и другие. 2017c). В то время как биосенсоры с качественными двоичными выходами стабильно работают в пробах с добавками (Duyen и другие. 2017), большее количество количественных биосенсоров показало степень извлечения 95–101% и согласованные результаты с ВЭЖХ и ЖХ / МС (Pikkemaat и другие. 2010 Чжан, Цзо и Е 2015 Чен и другие. 2017c). Большинство традиционных биосенсорных методов для обнаружения антибиотиков основаны на флуоресцентном или биолюминесцентном выходе в качестве метрики для локальной концентрации антибиотиков, с использованием считывателей планшетов или люминометров для определения выходных уровней (Korpela и другие. 1998 Куритту, Карп и Корпела 2000 Баль, Хансен и Соренсон 2005 Эльцов и другие. Пиккемаат, 2008 г. и другие. 2010). Однако порог обнаружения флуоресцентного выхода биосенсоров остается проблемой. Чтобы решить эту проблему, Меламед и его коллеги представляют инновационный метод обнаружения и идентификации различных типов антибиотиков. Они предоставляют панель из 12 штаммов бактериальных репортеров, оптимизированных для высокочувствительного флуоресцентного выхода, в сочетании с вычислительным алгоритмом, который анализирует кривые доза-реакция для каждого из них. флуоресцентный репортерный штамм в ответ на неизвестный антибиотик и определяет тип антибиотика на основе механизма действия (Меламед и другие. 2012 Меламед, Нафтали и Белкин 2014).

Хотя эти аналитические методы могут улучшить идентификацию антибиотиков по результатам биосенсора, флуоресценцию и биолюминесценцию по-прежнему трудно точно оценить в полевых условиях. Для решения этой проблемы были созданы биосенсоры с колориметрическим выводом, которые можно оценить невооруженным глазом качественно или количественно с помощью цифровой камеры и программного обеспечения для онлайн-анализа изображений (Fantino, Barras and Denizot 2009 Duyen и другие. 2017). Хотя эти решения по-прежнему ограничены в своей количественной чувствительности, их дизайн показывает многообещающую применимость в полевых условиях.

Еще одним препятствием для внедрения в полевых условиях является переносимость бактериальных биосенсоров за пределы лаборатории. Поскольку эти биосенсоры полагаются на здоровые бактерии, функция многих существующих биосенсоров оптимальна при 37 ° C и, следовательно, требует инкубатора. Однако недавние разработки в области иммобилизации клеток и миниатюрных устройств улучшили перспективы хранения живых клеток. Было продемонстрировано, что лиофилизация (сублимационная сушка) и восстановление оказывают незначительное влияние на функциональность бактериальных биосенсоров (Kurittu, Karp and Korpela 2000). Этот метод был успешно протестирован в внелабораторных полевых условиях для обнаружения тетрациклинов (Pikkemaat и другие. 2010). Другой метод хранения, использующий естественные способности некоторых бактериальных клеток, - это «спосенсор», удобное в использовании, готовое к эксплуатации устройство, которое содержит иммобилизованные бактериальные споры генно-инженерных Bacillus subtilis которые действуют как биосенсоры целых клеток. Хотя тестировался только на бацитрацине с уровнем детализации около 50 нг / мл, он был разработан специально для того, чтобы его можно было легко использовать в полевых условиях, используя только три пробирки и ограниченное количество реагентов, и поэтому он может быть моделью для будущей работы с использованием этих методов (Fantino, Баррас и Денизот 2009).

Чувствительность цельноклеточных биосенсоров остается более серьезным препятствием из-за ограничений чувствительности при обнаружении выходного сигнала биосенсора, а не реакции самого биосенсора. Хотя колориметрические датчики обеспечивают надежный качественный подход без использования оборудования, они не идеальны для углубленного количественного анализа. Область биоинженерии предлагает мощную альтернативу: дизайн биочипа или `` лаборатория на чипе '', который объединяет биолюминесцентные биосенсоры целых клеток с миниатюрными фотоумножителями и детекторами с зарядовой связью (ПЗС) для усиления и преобразования сигнала. Затем этот результат можно проанализировать с помощью онлайн-программного обеспечения для получения количественного результата (Roggo and van der Meer 2017). В 2011 году Рода и его коллеги выполнили три различных биолюминесцентных анализа, реализовав ПЗС-визуализацию на миниатюрном устройстве с сконструированными бактериальными и дрожжевыми клетками. Хотя они не пытались обнаружить соединения антибиотиков с помощью своего устройства, успех трех различных анализов позволяет предположить, что этот метод может быть адаптирован для обнаружения антибиотиков с использованием различных штаммов бактерий. Было показано, что этот метод имеет надежный срок хранения до 35 дней при охлаждении, что делает его пригодным для транспортировки и использования в полевых условиях (Roda и другие. 2011).

В то время как биочипы быстро улучшаются в размерах и удобстве использования, наиболее экономичным полевым решением является бумажная основа. Колориметрические цельноклеточные биосенсоры на бумажной основе, включая «споросенсор», продемонстрировали инновационный дизайн, многообещающую функциональность и удобство использования, но по-прежнему лучше всего работают при 37 ° C, поскольку в них используются живые бактериальные клетки (Fantino, Barras and Denizot 2009). В качестве альтернативы могут использоваться бесклеточные системы, которые используют тот же клеточный аппарат, что и типичный биосенсор, размещенный на бумажной матрице, а не внутри живой клетки. Дуйен и его коллеги разработали бумажный in vitro система транскрипции / трансляции для обнаружения антибиотиков, подавляющих синтез белка. В то время как устройство наиболее эффективно работало при 37 ° C (2-часовая инкубация), обнаружение с сопоставимой чувствительностью можно постоянно достигать при температурах до 15 ° C, варьируя время инкубации. Благодаря повышению чувствительности, которая в настоящее время находится в диапазоне 500–6100 нг / мл, эта бумажная система демонстрирует потенциал для использования в полевых условиях (Duyen и другие. 2017).


Принадлежности

Отделение биохимии и молекулярной биологии, Институт питания и здоровья Аль-Кудса, Медицинский факультет, Университет Аль-Кудс, Абу-Деис, Западный берег, Палестина

Общество общественного здравоохранения Аль-Кудс, Иерусалим, Палестина

Кифая Азми, Валаа Крей и Зиад Абдин

Медицинский факультет, Институт питания и здоровья Аль-Кудс, Университет Аль-Кудс, Абу-Дейс, П.О. Box 20760, Западный берег, Палестина

Вы также можете найти этого автора в PubMed Google Scholar

Вы также можете найти этого автора в PubMed Google Scholar

Вы также можете найти этого автора в PubMed Google Scholar

Взносы

К.А. принимал участие во всех аспектах разработки исследования, его реализации, сбора образцов и написания рукописи. WQ участвовал в анализе образцов. ZA внесла свой вклад в пересмотр рукописи и общую поддержку этого исследования. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Автор, ответственный за переписку


Смотреть видео: Iata cum a fost descoperita penicilina! (August 2022).