Информация

Можно ли говорить о деацетилировании промотора, а не связанного с ним гистона?

Можно ли говорить о деацетилировании промотора, а не связанного с ним гистона?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Меня смущает деталь в статье, которую я читаю, и я не уверен, неправильно ли я понимаю формулировку или концепцию. Я включаю в качестве справочной информации весь реферат этой статьи:

Эпигенетическая регуляция биологии матки фактором транскрипции KLF11 посредством посттрансляционного деацетилирования гистонов метаболических ферментов цитохрома p450.

Чжэн Ю., Таббаа З.М., Хан З., Школьнмейстер Дж. К., Эль-Нашар С., Фамуйде А., Кини Г.Л., Дафтари Г.С.

Абстрактный:

Эндокринная регуляция биологии матки имеет решающее значение для восприимчивости эмбриона и воспроизводства человека. Эндометрий матки зависит от поступления внешних половых стероидов и, следовательно, вероятно, имеет механизмы, которые позволяют адаптироваться к гормональным изменениям. Новые данные свидетельствуют о том, что биодоступность половых стероидов в эндометрии определяется регулированием их скорости метаболизма и судьбы посредством регуляции ферментов цитохрома (CYP) p450. Ферменты CYP нацелены на повсеместно экспрессируемые Sp / Krüppel-подобные (Sp / KLF) факторы транскрипции. В частности, KLF11 высоко экспрессируется в репродуктивных тканях, регулирует множество эндокринных / метаболических путей с помощью механизмов, основанных на эпигенетических гистонах, и, если экспрессируется аберрантно, он связан с диабетом и заболеваниями репродуктивного тракта, такими как лейомиома и эндометриоз. Используя KLF11 в качестве модели для исследования эпигенетической регуляции метаболизма первого прохождения эндометрия, мы оценили экспрессию полного набора метаболических ферментов в клетках Исикавы. KLF11 подавлял большинство ферментов CYP эндометрия. Чтобы охарактеризовать задействованные KLF11 эпигенетические регуляторные механизмы, мы сосредоточились на ферменте, метаболизирующем эстроген, CYP3A4. Экспрессия KLF11 снижается в секреторной фазе эпителия эндометрия, что связано с повышенной экспрессией CYP3A4. Кроме того, KLF11 связывается с элементами GC промотора CYP3A4 и тем самым подавляет промотор, сообщение, белок, а также ферментативную функцию. Эта репрессия была эпигенетически опосредованной, потому что KLF11 совместно локализовался и задействовал корепрессор SIN3A / гистондеацетилазу, что привело к селективному деацетилированию промотора CYP3A4. Репрессия была отменена мутацией в KLF11, которая аннулировала рекрутирование и связывание кофактора. Это подавление также было фармакологически обратимым с ингибитором гистондеацетилазы. Фармакологическое изменение метаболизма эндометрия может иметь долгосрочные трансляционные последствия для репродуктивной функции человека и заболеваний матки.

Цитата:

Zheng Y, Tabbaa ZM, Khan Z, Schoolmeester JK, El-Nashar S, Famuyide A и др. Эпигенетическая регуляция биологии матки фактором транскрипции KLF11 посредством посттрансляционного деацетилирования гистонов метаболических ферментов цитохрома p450. Эндокринология. 2014; 155: 4507-20.

Мой вопрос касается предпоследнего предложения этого реферата:

«Эта репрессия была эпигенетически опосредована, потому что KLF11 совместно локализовался и задействовал корепрессор SIN3A / гистондеацетилазу, что привело к селективному деацетилированию промотора CYP3A4».

В этом предложении, по-видимому, говорится, что SIN3A / гистондеацетилаза деацетилирует сам промотор CYP3A4 (т.е. деацетилирует непосредственно область ДНК). Однако не должна ли гистондеацетилаза деацетилировать гистон, а не участок ДНК? Я неправильно понимаю механизм? Или «деацетилирование промотора CYP3A4» действительно сокращенное выражение «деацетилирование гистона, связанного с промотором CYP3A4»?

Заранее спасибо за помощь!


Авторы, очевидно, хотели написать, что гистоны, связанные с промотором, становятся деацетилированными. Они не могут означать сам промотор, поскольку это ДНК.

То, что они написали, не является стенографией или приемлемым альтернативным использованием, а просто ошибка - опубликованные статьи часто содержат опечатки и ошибки такого рода. Вероятно, авторы хотели написать технически правильную форму слов, но потеряли фразу. Или, возможно, они превысили лимит количества слов, разрешенных в резюме, и поэтому они прошли обрезку, но слишком сильно.

Почему это не подхватили судьи? Конечно, должны были, но их, вероятно, больше интересовало содержание статьи и то, оправдывают ли эксперименты, описанные авторами, их выводы. Они занятые ученые и, вероятно, выполняют свою работу добровольно.

В заключение, ученые - люди, научное писать сложно, и все делают ошибки. Но мы все равно должны пытаться передать наши идеи как можно яснее и, конечно, не копировать что-то технически неправильное или двусмысленное только потому, что оно уже напечатано.


Все дело в ДНК-белковых взаимодействиях. Промоторная область ДНК взаимодействует с модификациями гистонов, которые контролируются другими белками.


Арабидопсис гистондеацетилаза 6: зеленая ссылка на молчание РНК

Эпигенетическое перепрограммирование лежит в основе возникновения и прогрессирования рака. Как правило, снижение метилирования цитозина по всему геному контрастирует с гиперметилированием контрольных областей функционально хорошо установленных генов-супрессоров опухолей и многих других генов, роль которых в биологии рака еще не ясна. В то время как понимание механизмов, которые вызывают аберрантное метилирование цитозина в раковых клетках, только начинает появляться, инициирующие сигналы для аналогичного метилирования промотора у растений хорошо задокументированы. В Арабидопсис, молчание промоторов требует компонентов механизма РНК-интерференции и промоторной двухцепочечной РНК (дцРНК) для индукции репрессивного состояния хроматина, которое характеризуется метилированием цитозина и деацетилированием гистонов, катализируемым гистондеацетилазой RPD3-типа AtHDA6. Было показано, что аналогичные механизмы происходят у делящихся дрожжей и млекопитающих. В этом обзоре рассматривается связь между метилированием цитозина, дцРНК и AtHDA6-контролируемым деацетилированием гистонов во время сайленсинга промоторов в Арабидопсис и обсуждает потенциальное механистическое сходство этих событий подавления молчания в раковых и растительных клетках.


Фон

Внезапные изменения окружающей среды могут вызвать быстрые и драматические изменения в экспрессии генома. Это включает скоординированную экспрессию от сотен до тысяч генов, экспрессия которых точно модулируется по времени и величине. Многие различные факторы транскрипции функционируют в клетке в любой момент времени и реагируют на отдельные восходящие сигналы. Следовательно, клетки должны интегрировать действие многочисленных сигналов и регуляторных факторов для создания согласованной программы геномной экспрессии, адаптированной для каждой новой среды.

Дрожжи частично реагируют на стресс, инициируя реакцию на стресс в окружающей среде (СОЭ), которая состоит из примерно 600 генов, экспрессия которых подавляется, и примерно 300 генов, экспрессия которых индуцируется различными стрессами [1, 2]. Репрессированные гены включают примерно 130 генов рибосомных белков («RP») и отдельную группу из примерно 450 генов, более широко связанных с синтезом белка («гены PS»). Обе группы сильно экспрессируются в активно растущих клетках, но резко подавляются с немного разными профилями экспрессии в ответ на стресс. Гены, индуцируемые в СОЭ («гены iESR»), участвуют в различных аспектах защиты от стресса, включая окислительно-восстановительную регуляцию, сворачивание белков, осмо-толерантность, передачу сигналов клеток и другие функции. Инициирование СОЭ не требуется для того, чтобы пережить вызывающий стресс стресс, а скорее помогает защитить клетки от последующих тяжелых доз того же или другого стресса (хотя это не может полностью объяснить приобретенную устойчивость к стрессу во всех случаях) [3].

Хотя ESR активируется множеством различных стрессов, он регулируется по-разному в зависимости от окружающей среды. Многочисленные восходящие сигнальные пути участвуют в специфической регуляции СОЭ, включая глицерин с высокой осмолярностью (HOG) [4] (Джессика Кларк и APG, неопубликованные данные), MEC [5] и протеинкиназа C (Скотт Топпер и APG, неопубликованные) пути в ответ на осмотический шок, повреждение ДНК или восстанавливающие агенты соответственно, а также протеинкиназу А и мишень пути рапамицина (TOR) при снятии стресса [6–10] (обзор см. в [11]). Кроме того, различные подмножества генов iESR могут быть индуцированы стресс-специфическими факторами транскрипции, такими как фактор окислительного стресса Yap1p [1], фактор теплового шока Hsf1p [12–14], Sko1p и Hot1p при осмотическом стрессе [15–18]. ], и факторы транскрипции «общего стресса» Msn2p и Msn4p в ответ на различные стрессы (обзор в [11]). Однако мало что известно о том, как эти сигналы интегрируются, чтобы опосредовать инициацию СОЭ, или как гены, репрессированные в СОЭ, координируются с генами, индуцированными в программе.

Одним из механизмов изменения экспрессии генов является изменение состояния хроматина. Гистондеацетилаза Rpd3p деацетилирует гистоны как в кодирующих, так и в некодирующих областях, где, как полагают, она функционирует по крайней мере в двух различных комплексах (rev. [19, 20]). Небольшой комплекс (Rpd3S) подавляет инициацию скрытой транскрипции за счет деацетилирования гистонов после удлинения полимеразы [21–23]. Rpd3S рекрутируется посредством комбинированного действия субъединиц Eaf3p и Rco1p на гистон H3, метилированный с помощью Set2p во время транскрипции открытой рамки считывания [21–23]. Напротив, большой комплекс (Rpd3L) рекрутируется на промоторы с помощью сайт-специфических ДНК-связывающих белков, включая субъединицу Ume6p Rpd3L, где, как полагают, она участвует в инициации транскрипции [23-27]. Известно, что Rpd3p связывает разные промоторы в разных условиях, таких как холодовой шок и обработка рапамицином [28–30]. Фактически, многие промоторы, на которые перемещается Rpd3p, являются генами, репрессированными в ESR. Эффекты Rpd3p на этих промоторах не были показаны в глобальном масштабе, но результат предполагает, что Rpd3p необходим для стресс-зависимой репрессии генов ESR [11, 30].

Хотя гистоновые деацетилазы традиционно связаны с репрессией, они также могут функционировать во время активации генов [31–36]. Для индукции нескольких разных генов дрожжей требуется Rpd3p после обработки солью, гипоксии или повреждения ДНК [32–34]. Точный механизм не ясен, но требуется Rpd3p для рекрутирования РНК-полимеразы на промоторы генов (включая гены iESR), индуцированных осмотическим шоком и повреждением ДНК [32, 34]. Более того, индукция гипоксических генов требует Rpd3p-зависимого деацетилирования гистонов для замещения нуклеосом и стабильного связывания фактора транскрипции Upc2p в регуляторных областях генов [33]. То, что Rpd3p был связан со стресс-зависимой индукцией и репрессией генов, повышает вероятность того, что Rpd3p участвует в регуляции как индуцированных, так и репрессированных генов в СОЭ.

В самом деле, здесь мы показываем, что Rpd3p необходим для правильной инициации СОЭ, включая нормальную регуляцию как индуцированных, так и репрессированных генов, у дрожжей, отвечающих на множественные стрессы. Клетки отсутствуют RPD3 или субъединица Rpd3L PHO23 имел серьезный дефект, особенно во время переходной фазы сразу после H2О2 лечение, в то время как клетки, лишенные субъединицы Rpd3S RCO1 не. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) в генах-кандидатах ESR показала, что Rpd3p перемещается к многочисленным промоторам при стрессе, чтобы опосредовать деацетилирование гистонов, однако точный образец изменения хроматина был различным для разных исследованных нуклеосом и генов. Мы показываем, что Rpd3p напрямую связывается с генами, индуцированными стрессом, и необходим для нормального связывания Msn2p с многочисленными промоторами. Вместе эта работа предполагает использование Rpd3L как важного кофактора в регуляторной сети ESR.


Полученные результаты

Структуры G4 маркируют промоторы с повышенной заселенностью Pol II.

Чтобы исследовать, модулирует ли процесс транскрипции формирование структуры G4 в хроматине, мы использовали широко охарактеризованную линию клеток хронического миелогенного лейкоза человека K562 в качестве модельной системы [13]. Формирование структуры G4 определяли с помощью G4 ChIP-seq [14], доступность хроматина с помощью ATAC-seq (анализ доступного для транспозаз хроматина с использованием секвенирования) и занятость Pol II с помощью Pol II ChIP-seq (рис. 1a). Согласно консенсусу, эндогенные G4 были определены как пики G4 ChIP-seq, присутствующие по крайней мере в двух из трех биологических повторов (корреляция Пирсона р & gt 0,96). Большинство согласованных пиков G4 (> 75%) содержат мотивы последовательности G4, которые, как было независимо показано, сворачиваются в структуру G4 in vitro с помощью анализа задержки ДНК-полимеразы (G4-seq Дополнительный файл 1: Рис. S1A) [15 ]. В клетках K562 консенсусные G4 были сильно обогащены промоторами (определяемыми как TSS ± ​​500 п.н. Дополнительный файл 1: рис. S1B), далее называемые промоторами G4. Промоторы G4 маркируют гены со значительно повышенной экспрессией по сравнению с промоторами, не имеющими структуры G4 (п & lt 2.2 × 10 - 16 Дополнительный файл 1: Рис. Набор данных S1C RNA-seq Регистрационный номер GEO. GSE88473). ATAC-seq на трех независимых биологических повторах (корреляция Пирсона р & gt 0,98) далее показали, что большинство всех согласованных G4 (88,2%) были расположены в отчетах о недоставке (дополнительный файл 1: рис. S1D), как показано на примере МОЙ С а также КРАС промотор G4s (рис. 1б). Эти результаты подтверждают наши предыдущие наблюдения в клетках HaCaT и первичных кератиноцитах [5] и подтверждают, что эндогенные G4 главным образом обнаруживаются в открытом хроматине на промоторах. Учитывая, что эндогенный промотор G4s маркирует повышенную транскрипцию, в качестве первого шага мы определили занятость Pol II в таких генах. Использование Pol II ChIP-секвенирования (5 биологических повторений корреляции Пирсона р & gt 0,99), мы наблюдали значительно более высокую занятость Pol II на промоторах с эндогенным G4 по сравнению с промоторами без (п & lt 2.2 × 10 - 16 Рис. 1в). Чтобы выяснить, как на образование G4 может влиять активная транскрипция и способствует ли образование G4 более открытой по сравнению с компактированной средой хроматина, мы сосредоточили большинство следующих исследований исключительно на промоторах G4 (TSS ± ​​500 bp), занятых Pol II.

Транскрипция не является необходимой для образования G4 в промоторах. а Обзор экспериментального дизайна. Черный, данные, полученные в этом исследовании. Синий, опубликованные наборы данных RNA-seq. б Репрезентативные примеры геномных треков G4 ChIP-seq в клетках K562 для МОЙ С а также КРАС. Дорожки сверху вниз показывают сигнал G4 ChIP-seq (желтый), входной контроль G4 ChIP-seq (желтый), сигнал ATAC-seq (зеленый) и мотивы последовательностей, которые могут образовывать G4 in vitro (определенные как сайты G4-seq, см. ссылка [15]) на прямой (+ ss) или обратной (−ss) цепи (синий). Сигнал количественно выражается в количестве на миллион (CPM). c Коробчатая диаграмма сигнала Pol II ChIP-seq (лог2CPM) на промоторах (TSS ± ​​500 п.н.) в доступном хроматине (ATAC +) с эндогенным G4 (G4 ChIP +) или без G4 (G4 ChIP-), но с мотивами последовательностей, которые могут складываться в структуры G4 in vitro (G4- seq). Тест Вилкоксона: п & lt 2,2 × 10 - 16. d Графическое представление экспериментов по образованию G4 и ингибированию транскрипции. е Вестерн-блоттинг для Pol II Ser2-P и общего Pol II из клеток K562, обработанных 100 мкМ DRB или без него, в течение 1 часа. ß-актин обеспечивает контроль нагрузки. ж График Bland Altman (MA), показывающий кратное изменение сигнала G4 ChIP-seq на промоторах между DRB-обработанными и DMSO-обработанными клетками K562. Статистически значимый (п & lt 0,01) более высокие и более низкие сигналы показаны красным и синим, соответственно, черные точки указывают области, которые не меняются. грамм Вестерн-блоттинг для Pol II Ser5-P и общего Pol II для клеток K562, обработанных 10 мкМ триптолида (TPL) или без него, в течение 30 минут или 2 часов. ß-актин обеспечивает контроль нагрузки. час График МА, аналогичный панели F, иллюстрирующий кратное изменение сигнала G4 ChIP-seq на промоторах между обработанными TPL и необработанными клетками K562 (п & lt 0,01)

Формирование промотора G4 не требует активной транскрипции.

Мы непосредственно оценили, требуется ли активная транскрипция для образования промотора G4s, как было предложено [12, 16], путем измерения того, вызывает ли ингибирование транскрипции потерю G4s (Fig. 1d). Для подавления элонгации транскрипции клетки K562 обрабатывали ингибитором CDK9 5,6-дихлорбензимидазол-1-β-d-рибофуранозидом (DRB) для предотвращения приостановленного высвобождения Pol II [17, 18]. Обработка DRB (1 час) снижает фосфорилирование Pol II по серину 2 без влияния на общие уровни Pol II, как видно с помощью вестерн-блоттинга (рис. 1e), подтверждая ожидаемый механизм ингибирования. Клетки, обработанные DRB, и контрольные клетки, обработанные ДМСО, подвергали G4 ChIP-seq. Промотор G4 в клетках, обработанных DRB по сравнению с DMSO, не показал статистически значимых изменений в сигнале ChIP G4 в большинстве сайтов (п & lt 0,01 5/4023, 0,1% вверх, 136/4023, 3,4% вниз (рис. 1f). Таким образом, ингибирование Pol II-зависимой элонгации не приводит к потере образования G4 на промоторах, скорее, укладка G4 на промоторах должна предшествовать продуктивному удлинению транскрипции.

Чтобы оценить, вызывает ли ингибирование инициации транскрипции потерю промотора G4, мы использовали триптолид (TPL), который ковалентно ингибирует Pol II-ассоциированную геликазу XPB [19]. Как видно с помощью вестерн-блоттинга, 2-часовая обработка TPL приводит к значительной потере фосфорилирования серина 5 Pol II и общей потере уровней белка Pol II (рис. 1g). Однако ингибирование TPL не привело к значительному снижению общего сигнала промотора G4-ChIP (п & lt 0,01 11/4268 вниз, 0,3% Рис. 1h). И наоборот, значительное число (п & lt 0,01 449/4268 вверх, 10,5%) промотора G4s показали усиление сигнала G4 после обработки TPL. Это контрастирует с экспериментами на клетках аденокарциномы человека, которые не показали изменений G4 после лечения TPL [20]. Наше наблюдение увеличения образования G4 на промоторах после обработки TPL, вероятно, связано с отменой геликазной активности G4-разрешающих геликаз XPB / XPD [19, 21]. В отличие от более ранних работ, предполагающих, что фолдинг G4 стимулируется активной транскрипцией посредством генерации одноцепочечной ДНК [12], наши результаты предполагают, что активная транскрипция не является необходимой для фолдинга G4 в промоторах.

Эндогенный промотор сворачивания G4 чувствителен к уплотнению хроматина.

Учитывая, что ингибирование транскрипции не удаляет промотор G4 в хроматине, и поскольку релаксация хроматина за счет ингибирования гистондеацетилазы может увеличивать их образование [5], мы предположили, что состояние хроматина может регулировать образование промотора G4. Чтобы исследовать это, мы использовали гипоксию для управления состоянием хроматина (рис. 2а). Гипоксия вызывает глобальное уплотнение хроматина [22, 23], характеризующееся повышенной экспрессией гетерохроматинового белка HP1BP3 [24], повышенным метилированием гистона H3 лизина 9 (H3K9me3) [25] и сниженным ацетилированием гистонов [26]. Клетки K562 подвергали воздействию острой гипоксии (1% кислорода, 1 ч). Гипоксия была подтверждена вестерн-блоттингом для индукции индуцируемого гипоксией фактора 1α [27] (рис. 2b).Полногеномное уплотнение хроматина при гипоксии было продемонстрировано снижением чувствительности к расщеплению микрококковой нуклеазой [28] (дополнительный файл 1: рис. S2A). Более того, в гипоксическом хроматине ATAC-seq показывает увеличенные размеры фрагментов, согласующиеся с уплотнением хроматина (дополнительный файл 1: рис. S2B). Дополнительное подтверждение индукции гипоксии было дано уменьшением занятости Pol II, наблюдаемым в генах, которые, как известно, имеют пониженную экспрессию в гипоксических клетках K562 [29] (дополнительный файл 1: рис. S2C).

Уплотнение хроматина уменьшает сворачивание промотора G4. а Графическое изображение экспериментального плана, исследующего G4, транскрипцию и уплотнение хроматина, вызванное гипоксией. б Вестерн-блоттинг на HIF1α из клеток K562, культивированных в нормоксических или гипоксических условиях. ß-актин обеспечивает контроль нагрузки. c Доступность хроматина на промоторах в нормоксических условиях. Верхняя панель, метагенный график для медианы нормализованного сигнала ATAC (3 биологических повтора) с центром в TSS в нормоксических условиях. Зеленый, промоторы активных генов с G4 (Pol II + G4 +) синий, активные гены без промотора G4 (Pol II + G4 -). Нижняя панель, данные нанесены на отдельные локусы и представлены тепловыми картами. d – f Графики МА, показывающие кратное изменение сигнала ATAC-seq (d), Сигнал G4 ChIP-seq (е) и сигнал Pol II ChIP-seq (ж) после гипоксии на активных промоторах с G4 (Pol II + G4 +). Синий и красный - участки со значительно сниженным или повышенным сигналом соответственно (п & lt 0,05). Счетчик чтения за тысячу показов на миллион. грамм Геномный взгляд на EIF4E-BP1 а также KCTD5 иллюстрируют гены, которые значительно изменяются в пиках ATAC-seq (зеленый), Pol II ChIP-seq (черный) и G4 ChIP-seq (желтый). Дорожки сравнивают пики между гипоксией и нормоксией. Геномные координаты указывают диапазон треков, а сигнал количественно выражается в количестве на миллион (CPM). Во всех панелях нормоксия относится к клеткам, культивируемым в 21% O.2 а гипоксия относится к клеткам, подвергшимся воздействию 1% O2 на 1 час

Сначала мы определили статус хроматина активных промоторов генов при нормоксии (21% O2) с помощью ATAC-seq и обнаружили, что промоторы, меченные G4 (т.е. Pol II + G4 +), расположены в более доступном хроматине по сравнению с их активными не-меченными G4 (т.е. Pol II + G4 -) аналогами (рис. 2c). Затем индукция гипоксии приводила к значительному снижению интенсивности сигнала ATAC-seq на большинстве сайтов промотора G4 (п & lt 0,05 7920/9217 вниз, 85,9% Рис. 2d). Для сравнения, промоторы, не меченные G4, обнаруживают гораздо меньшее уплотнение хроматина (дополнительный файл 1: рис. S2D). После индукции гипоксии примерно пятая часть промотора G4 показала статистически значимое снижение интенсивности сигнала (п & lt 0,05 1105/5558 вниз, 19,9% (рис. 2e), что указывает на то, что многие промоторы G4 чувствительны к уплотнению хроматина. Затем мы подтвердили общий принцип потери G4 при уплотнении хроматина, связанном с гипоксией, с использованием дополнительной неродственной клеточной линии. Острая гипоксия в клетках U2OS остеосаркомы человека также вызывала уплотнение хроматина и приводила к снижению интенсивности сигнала G4 на промоторах (п & lt 0,05 6150/8505 вниз, 72,3% Дополнительный файл 1: Рис. S3).

В гипоксических клетках K562 мы также наблюдали значительную потерю общей интенсивности сигнала Pol II на промоторах Pol II + G4 + (п & lt 0,05 1348/8307 вниз, 16,2% (Рис. 2f), при этом потеря Pol II почти полностью происходит на участках, где G4s были уменьшены (Дополнительный файл 1: Рис. S2E). Эти результаты проиллюстрированы видами браузера генома на рис. 2g. Напротив, у промоторов Pol II + G4 - была незначительная потеря Pol II (дополнительный файл 1: рис. S2F). Таким образом, уплотнение хроматина вызывает потерю многих промоторов G4 с сопутствующей потерей Pol II.

Стабилизация G4 небольшими молекулами противодействует потере G4 и Pol II при гипоксии

Чтобы напрямую проверить, влияет ли стабилизация G4 на образование G4 при гипоксии, мы визуализировали ядерные фокусы G4 [30] с использованием клеток U2OS, поскольку клетки K562 не поддались визуализации G4. pyPDS, аналог PDS с улучшенной липофильностью (clogP PDS 2.35, pyPDS 4.79, рассчитанный с использованием MarvinSketch версии 20.19.0), использовался для стабилизации G4 [31, 32] (дополнительный файл 1: рис. S4A). При гипоксии без pyPDS общая интенсивность сигнала G4 и количество очагов G4 были снижены (п & lt 0,0001, Дополнительный файл 1: Рис. S5). Однако с добавлением pyPDS было потеряно меньше G4 (п & lt 0,0001), показывая, что стабилизация G4 защищает G4 от развертывания при гипоксии.

Учитывая, что уплотнение хроматина приводит к потере Pol II в сайтах, где снижены промоторы G4, мы оценили, может ли индуцированная персистенция структур G4 при гипоксии, вызванная стабилизацией G4, вызывать сохранение связывания Pol II РНК (рис. 3a). Используя ATAC-seq с клетками K562, мы сначала подтвердили, что обработка pyPDS существенно не изменяет доступность хроматина при нормоксии и что уплотнение хроматина все еще происходит в условиях гипоксии (рис. 3b, дополнительный файл 1: рис. S4B). Для промоторов Pol II + G4 + мы обнаружили, что обработка pyPDS снижает потерю Pol II в 10 раз при гипоксии по сравнению с обработанными ДМСО клетками (10,6% против 1,2% соответственно, п & lt 0,05 Рис. 3c, d Дополнительный файл 1: Рис. S4C-D). Эти результаты подтверждаются просмотром браузера генома для промоторов регуляторов хроматина. BRD4 а также CBX1 (Рис. 3e). Кроме того, никаких изменений Pol II не наблюдалось при обработке pyPDS при нормоксии (дополнительный файл 1: рис. S4E) или при промоторах, не меченных G4, в гипоксических клетках, обработанных pyPDS (дополнительный файл 1: рис. S4F). Эти результаты исключают неспецифические лиганд-ассоциированные эффекты на рекрутирование Pol II. Таким образом, индуцированная устойчивость структуры G4, которая в противном случае была бы потеряна во время уплотнения хроматина, вызывает сохранение связывания Pol II.

Стабилизация G4 в уплотненном хроматине сохраняет занятость промотора Pol II. а Графическое изображение экспериментального плана, изучающего последствия стабилизации G4 с помощью pyPDS на уплотнение хроматина и заполнение Pol II. б Различия в доступности хроматина для промоторов активных генов с G4 (Pol II + G4 +) в условиях гипоксии для клеток, обработанных ДМСО или pyPDS. Верхняя панель, метагенный график сигнала ATAC с центром в TSS, показывающий разницу сигналов между гипоксическими клетками, обработанными DMSO и pyPDS. Нижняя панель, данные нанесены на отдельные локусы и представлены в виде графика тепловой карты. c Диаграмма Венна, показывающая участки, которые потеряли занятость Pol II между нормоксическими и гипоксическими клетками, обработанными ДМСО, и его перекрытие с участками Pol II, потерянными при обработке pyPDS в условиях гипоксии по сравнению с обработкой ДМСО в условиях нормоксии. Это показывает, что большая часть сайтов Pol II, сниженных при гипоксии, сохраняется с помощью pyPDS. d Подобно панели б но для разницы сигналов в занятости Pol II. е Просмотр в браузере генома, отображающий примеры генов, участвующих в биологии хроматина (например, BRD4 а также CBX1), которые показывают изменения в доступности хроматина (ATAC-seq, зеленый) и занятости Pol II (Pol II ChIP-seq, черный) для клеток в нормоксических (вверху), гипоксических (в центре) или гипоксических условиях, обработанных pyPDS (внизу). Координаты генома указаны выше, а сигнал количественно выражен в количестве на миллион (CPM).


Модификации гистонов и астма. Интерфейс эпигенетического и генетического ландшафтов

На сложные заболевания легких, такие как астма, влияют как генетическая предрасположенность, так и факторы окружающей среды. Эпигенетический ландшафт таких заболеваний привлекает все больший интерес и исследования. Эпигенетика широко охватывает преходящие и наследуемые изменения экспрессии генов, которые не связаны напрямую с изменениями нуклеотидных последовательностей. Эпигенетические механизмы могут иметь значительное влияние на связанные с астмой аллергические, иммунные и регуляторные пути, а также на генерацию биомаркеров и наследственную передачу фенотипов астмы. Последние технологические достижения позволили составить карту эпигенома и проанализировать эпигенетические факторы, способствующие развитию болезни в масштабе всего генома. В результате появились новаторские наблюдения относительно посттрансляционных модификаций гистонов при ряде иммунологических заболеваний. В этом обзоре мы не ограничиваемся биологической информацией, кодируемой ДНК, и рассматриваем эпигенетические модификации гистонов с доказательствами, указывающими на роль этих модификаций при астме.

Астма характеризуется воспалением дыхательных путей и обратимой обструкцией дыхательных путей, при этом хронические воспалительные процессы все чаще выявляются и подтверждаются. Описан ряд клинических и биологических фенотипов астмы и идентифицировано множество различных триггеров астмы (1). Несмотря на это, патогенез астмы на клеточном, молекулярном и генетическом уровнях менее ясен. Мишени из одного гена были плохо воспроизведены в обширных генетических исследованиях, и их вклад в клинические конечные точки неясен. Существуют эффективные методы лечения и стратегии лечения астмы легкой и средней степени тяжести, но нет лекарства.

Плохая репликация отдельных генов-мишеней проиллюстрирована многочисленными общегеномными ассоциативными исследованиями (2–5). Они представляют собой мощные независимые от гипотез исследования, идентифицирующие множество однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), связанных с астмой, таких как гиперреактивность бронхов или поляризация Т-хелперов (Th) 2. При воспроизведении этих анализов возникают трудности, которые можно объяснить гетерогенностью астмы и большим количеством наблюдаемых фенотипов. Фенотип астмы можно оценить по множеству переменных, включая возраст начала (в детстве / у взрослых), тип триггера (аллергия, чувствительность к аспирину, метабисульфит, менструальный цикл, физическая нагрузка, холодный воздух и т. Д.), Тип воспаления дыхательных путей. (нейтрофильный, эозинофильный или малоклеточный), тип Т-клеточного ответа (Th2 или Th17) и различные ответы на терапию. У каждого фенотипа астмы, вероятно, своя уникальная биология, поэтому идентификация биомаркеров и генов-мишеней непоследовательна (1). Некоторые реплицированные гены-кандидаты на астму включают оросомукоидную (ORM) (дрожжевую) изоформу 3 белка, рецептор IL-4, рецептор IL-6, IL-33, рецептор IL-1, подобный 1, металлопептидазный домен дезинтегрина и металлопротеиназы (ADAM). 33 и подавление онкогенности 2 (2–5). Хотя эти наблюдения обнадеживают, они, по-видимому, объясняют менее 5% наследственности астмы (6).

Эта слабая генетическая корреляция контрастирует с высоким уровнем конкордантности астмы в исследованиях монозиготных близнецов (около 70% наследственности) (7). Это говорит о том, что значительный наследственный компонент заболевания не выявляется путем скрининга генетических мутаций, что, в свою очередь, предполагает роль эпигенетических факторов. Взаимодействие между генетикой, эпигенетикой и окружающей средой убедительно свидетельствует о том, что ни одна генетическая мутация не будет причинной. Иммунологический ответ на раздражители окружающей среды является центральным для астмы, и получение более глубокого понимания причины иммунного отклонения и роли эпигенетики при астме имеет решающее значение.

Термин «эпигенетика» охватывает как преходящие, так и наследуемые изменения экспрессии генов, которые не связаны напрямую с изменениями нуклеотидных последовательностей. Эти модификации могут передаваться через клеточное деление как в мейозе, так и в митозе. Три основных эпигенетических механизма: (1) Метилирование ДНК (2) взаимодействия и действия некодирующей РНК и (3) гистоновая модификация. Метилирование цитозина ДНК происходит в ключевых сайтах, препятствуя связыванию транскрипционного аппарата с промотором или энхансером гена или экспрессии мРНК целевого гена в целом. Некодирующая РНК регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Они взаимодействуют с мРНК различными способами, изменяя экспрессию генов. Третья форма эпигенетики включает посттрансляционные модификации гистонов (PTM), которые изменяют белковую структуру комплексов октамеров гистонов внутри нуклеосомы без изменения последовательности ДНК (рис. 1). Это имеет ключевое значение для биохимического состава и координации ремоделирования хроматина и доступности ДНК для транскрипционного аппарата.

Рисунок 1. Комплекс октамеров гистонов и известные посттрансляционные модификации гистонов. Октамерный комплекс состоит из ядерных гистонов H2A, H2B, H3 и H4 и ДНК, которая обернута вокруг гистонового октамерного комплекса и связанного с ним гистона H1, стабилизируя структуру хроматина более высокого порядка. Показаны некоторые из остатков, которые подвергаются посттрансляционным модификациям, и их общепринятые модификации активации / репрессии. Специфические модификации одних и тех же остатков гистонов оказывают сайт-специфическое влияние на доступность генов для транскрипционного аппарата, что более подробно показано на Рисунке 2. K, лизин R, аргинин T, треонин S, серин Y, тирозин. Шестиугольники, метилирование треугольники, ацетилирование квадраты, фосфорилирование зеленый, активируя модификацию красный, деактивирующая модификация апельсин, модификация перекрестного разговора.

Некоторая сложность эпигенетики заключается в обратимых и частично наследуемых гистоновых ПТМ, которые могут как контролировать, так и контролироваться геномом (8, 9). Модификации гистонов не обладают такой же верностью на протяжении клеточного деления, как метилирование ДНК, при этом некоторые модификации восстанавливаются до сопоставимых уровней после S-фазы, а другие нет (10). В частности, это может происходить, поскольку модификации гистонов зависят от генетически кодируемых ферментов для регулирования структуры гистонов на протяжении мейоза и митоза. Противоположным этому обобщению является сообщение о триметилировании (me3) лизина 27 по гистону 3 (H3K27me3) в половых клетках, демонстрирующих сайт-специфическое наследование через несколько мейотических раундов репликации, в отсутствие связанной гистон-метилтрансферазы в Caenorhabditis elegans (11). Этот тип эпигенетической памяти еще не наблюдался у людей, и механизм остается неясным, однако это может быть связано с генетической избыточностью модификаций гистонов.

Хотя модификации гистонов сами по себе являются эпигенетическими модификациями, было показано, что вариации последовательности ДНК влияют на состояние хроматина. Kasowski и его коллеги (12) проанализировали вариацию состояний хроматина у 19 человек путем картирования модификаций гистонов в линиях лимфобластоидных клеток, полученных от пациентов, с использованием иммунопреципитации хроматина и высокопроизводительного секвенирования. Они показали, что хроматиновый ландшафт наиболее изменчив в областях энхансера и промотора и что эта вариация является наследственной, и приписали это SNP в сайтах связывания факторов транскрипции. Два других недавних исследования также предоставляют доказательства этого, демонстрируя, что состояния хроматина являются аллельспецифическими и находятся под влиянием регуляторного аппарата, в частности связывания факторов транскрипции (9, 13).

Технологические достижения в эпигеномном анализе (14) предоставили жизненно важные инструменты для изучения наследования модификаций гистонов и их эффектов при астме. В утробе Было показано, что добавление диеты, богатой донорами метилов, усиливает признаки аллергического заболевания дыхательных путей на модели мышей в двух поколениях за счет метилирования ДНК (15). Это наблюдение отражено аналогичным образом у людей, где мы видим повышенный риск развития астмы у внуков курильщиков по отцовской линии и еще более высокий риск, когда мать также подвергалась воздействию сигаретного дыма во время беременности (16). Этот дисбаланс в родительском наследовании может быть отнесен к геномному импринтингу (17), процессу молчания генов, специфичных для родителей происхождения, где метилирование гистонов играет направляющую роль, маркируя импринтирующие контролирующие области для последующего метилирования ДНК (18). Поскольку ферменты, модифицирующие гистоны, могут подвергаться приобретенным генетическим мутациям в дополнение к стимулам окружающей среды, гистоновые ПТМ скорее не полностью соответствуют классическому определению эпигенетики, они являются мостом между генетическим и эпигенетическим ландшафтами.

Структура хроматина не является инертным каркасом для упаковки геномной информации, это жидкая и информативная карта транскрипционного потенциала, специфичного для всей клетки. Он может меняться в результате внутренних или внешних стимулов, или как фактор или ответ на решения клеточной судьбы во время клеточной дифференцировки. Центральное место в контроле хроматина занимают специализированные ферменты модификации гистонов, которые могут биохимически удалять, корректировать или добавлять изменения в гистоновые единицы.

Нуклеосома, основная единица хроматина, состоит из приблизительно 142 пар оснований (п.н.) ДНК, обернутых вокруг гистонового октамерного комплекса. Этот комплекс состоит из двух наборов субъединиц корового гистонового комплекса, H2A и H2B, а также H3 и H4, вместе с ассоциированным межнуклеосомным ДНК-стабилизирующим гистоновым белком H1 (рис. 1). ДНК, которая плотно прилегает к белковому каркасу, защищена от транскрипционных механизмов и ферментов PTM из-за своей компактной природы. Это также защищает ДНК от других эпигенетических модификаций, таких как метилирование ДНК (19). Элегантные исследования переваривания ДНКазой I в очищенных экстрактах цельной ДНК в 1980 г. дали полосы размером примерно 142 п.н., предполагая, что эта область защищена от ферментативной активности (20). Таким образом, структура хроматина вокруг гена способна шаперонировать, когда и где эта последовательность ДНК транскрибируется и экспрессируется. Следовательно, на экспрессию генов влияет множество факторов, включая факторы транскрипции, внешние стимулы и PTM гистонов, ремоделирующих хроматин.

Модификации гистонов происходят на N-концевых хвостах каждого гистона в октамере (Рисунок 1). Все «основные» остатки можно модифицировать, однако есть ключевые остатки лизина, серина, аргинина, тирозина и треонина, которые являются мишенями для модификации, тем самым изменяя структуру гистонового комплекса, чтобы способствовать или подавлять активность локального гена. Это может включать метилирование (me), ацетилирование (ac), фосфорилирование, убиквитинирование или сумоилирование, все это регулируется специфическими ферментами (21). Модификации гистонов (в частности, метилирование лизина на гистоне 3) могут иметь как активирующие, так и репрессивные функции в отношении экспрессии генов (Рисунок 2). Модификации гистонов также могут действовать как сигналы, распознаваемые факторами транскрипции и кофакторами, регулирующими экспрессию генов (21).

Фигура 2. Гистоновый код некоторых ключевых остатков лизина на гистоне H3. (А) Общий гистоновый код. Модификации, специфичные для остатков, связаны с экспрессией активного или подавленного гена. Степень и тип модификации каждого остатка (лизины 4, 9, 14, 20, 27, 36 и 79 гистона H3, представленные синие круги) по-разному влияют на экспрессию генов (например, монометилирование [me1], диметилирование [me2], триметилирование [me3] и ацетилирование [ac]). Помимо индивидуального воздействия этих модификаций, это совместная локализация лизина-4 на модификациях гистона-3 (активный H3K4me3) и H3K27me3 (репрессивный), которые при обнаружении в промоторных областях приводят к двухвалентному состоянию, в котором экспрессия генов сбалансирована. для активации. (B) Сайт-специфичное влияние некоторых модификаций гистонов. Местоположение модификации в контексте гена имеет значение. Например, H3K4me3 часто обнаруживается только в промоторной области активно транскрибируемых областей, тогда как метилирование H3K36 обнаруживается через транскрипционно активный ген в кодирующей области ближе к 3'-концу (23).Эти основные цифры представляют только некоторые из известных модификаций остатков лизина гистона H3. Существует множество модификаций, которые могут быть внесены в эти и другие остатки гистонов в октамерном комплексе.

Степень модификации каждого остатка гистона, а также комбинация и расположение модификаций могут оказывать заметно различное влияние на экспрессию генов и структуру гистонов. Это справедливо для разных типов клеток, указывая на возможность фенотипического репрограммирования. Например, me3 гистон-3 – лизин-4 (H3K4) обнаруживается в высокообогащенных промоторных областях размером 1 т.п.н. в сайтах старта транскрипции активных генов, тогда как диметилирование (me2) или монометилирование (me1) того же остатка лизина далее наблюдается в кодирующих областях активно транскрибируемых генов (22, 23). Существующие ранее модификации в одном и том же октамере гистонов также могут определять, какие дополнительные колокализованные (СНГ) и смежные (транс) могут происходить модификации, и это может зависеть от ячейки. Например, H3K9me и H3K14ac могут сосуществовать на одной и той же молекуле в клетках человека, тогда как в куриных эритроцитах они исключают друг друга (21).

Существует множество ферментов, регулирующих ПТМ гистонов, которые в значительной степени консервативны у эукариот. На их выражение влияют как генетические факторы, так и факторы окружающей среды. Например, сигаретный дым индуцирует экспрессию гена H3K27me3-специфичного фермента деметилазы: лизин (K) -специфической деметилазы (KDM) 6A (24). Этот фермент действует через свой функциональный домен белка Jumonji, характерный для большого семейства гистоновых деметилаз, способных удалять остатки триметилированного лизина из гистонов (24). Повышение регуляции этого фермента приводит к удалению сайтов супрессивного метилирования и активирует гены, связанные с прохождением клеточного цикла через путь ретинобластомы в клеточных линиях рака почки (24, 25). Подобным образом пассивное вдыхание дыма у детей с тяжелой астмой резко снижает экспрессию гена гистондеацетилазы (HDAC) 2 (26) в альвеолярных макрофагах. HDAC2 может деацетилировать множественные модификации ацетилирования по остаткам лизина на гистоне 3 и гистоне 4 (26). HDAC2 вовлечен в патофизиологию хронической обструктивной болезни легких, где его уменьшение происходит вторично по отношению к усилению окислительного и ниттивного стресса в легких. Он активируется кортикостероидами, тем самым подавляя экспрессию воспалительных генов и уменьшая повреждение легких (27). Терапевтический потенциал генов модификации гистонов имеет убедительную доказательную базу, особенно HDAC2 при астме. Немногие клинические испытания нацелены на конкретные HDAC, и вместо этого используются ингибиторы широкого спектра действия, такие как трихостатин А и вальпроевая кислота, что может приводить к нецелевым эффектам и дает плохое понимание действия ингибиторов HDAC (28).

Помимо стимулов окружающей среды, генетические влияния могут влиять на PTM гистонов с мутациями гистон-модифицирующих ферментов и их шапероновых белков, изменяя распределение паттернов метилирования гистонов. Консорциум GABRIEL (мультидисциплинарное исследование по выявлению генетических и экологических причин астмы в европейском сообществе) полногеномное исследование ассоциации субъектов с астмой выявило важные SNP (п ≤ 0,01) в составе ферментов модификации гистонов, KDM2A, KDM4C, HDAC4, HDAC7, HDAC9 (29). Функциональное влияние этих наблюдаемых SNP еще предстоит проанализировать, и из-за гетерогенности астмы тщательный анализ конкретных фенотипов может выявить дополнительные релевантные SNP. Каталитически инактивирующие мутации гистон-метилтрансферазы, усилителя гомолога 2 zeste (Ezh2), специфически усиливают пластичность Т-клеток и благоприятствуют фенотипу Th2 с увеличением циркулирующего IgE (30) (рис. 2). EZH2 обладает высококонсервативным доменом SET, позволяющим ему триметилировать H3K27. Делеция домена SET в CD4 + Т-клетках увеличивает тяжесть заболевания на модели животных с аллергической астмой, что совпадает с накоплением Th2-клеток памяти (30). Мутации с потерей функции также были исследованы в шаперонном белке фермента модификации гистонов, супрессоре вариегации 3–9, гомологе 1 (SUV39H1). Мутации SUV39H1 приводят к образованию каталитически неактивного продукта, который не может воздействовать на подмножество генетических локусов Th1-типа для сайленсинга. Нормальная роль этого гена обеспечивает сайт связывания для гетерохроматинового белка 1a, медиатора подавления гена через взаимодействие с различными ферментами модификации гистонов (30). Без шаперона SUV39H1 этот медиатор гена не может обеспечить стабильную линию Th2 в клетках, которые содержат эти инактивирующие мутации (31).

Хотя большинство ферментов модификации гистонов специфичны для остатков, на которые они нацелены, некоторые из них обладают пониженной верностью к гистоновым белкам и могут также модифицировать негистоновые белки. Примеры включают ряд гистоновых ацетилтрансфераз и деацетилаз (32), а также гистоновые метилтрансферазы, такие как SET, содержащие домен 7 (SETD7) (33). SETD7 монометилирует H3K4 (H3K4me1), активирующую модификацию, но также имеет несколько негистоновых субстратов, относящихся к патологиям астмы, включая: преобразователь сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT3) (34), опухолевый белок p53 (35), рецептор эстрогена-α ( 36), ДНК-метилтрансфераза 1 (37), фактор транскрипции E2F 1 (38) и субъединица p65 / RelA ядерного фактора-κB (NF-κB) (39). Интересно, что метилирование SETD7 остатка лизина K140 на STAT3 изменяет этот фактор транскрипции, который является частью промотора регулируемого STAT3 супрессора передачи сигналов цитокинов (SOCS3), который был идентифицирован как драйвер астмы (40). Цитокины, ассоциированные с астмой, такие как IL-6, способствуют этому негистоновому метилированию, что приводит к диссоциации STAT3 от промотора SOCS3 и увеличению экспрессии SOCS3 (рис. 3). Таким образом, SETD7 позволяет происходить эпигенетическому и генетическому связыванию и имеет решающее значение для поддержания нормального клеточного ответа на цитокины (34).

Рисунок 3. SET-домен-содержащее (SETD) 7 деметилирование негистоновых белков является негативным регулятором иммунного ответа Т-хелперного (Th) 2-типа. Стимуляция IL-6 приводит к фосфорилированию преобразователя сигнала и активатора транскрипции (STAT) 3 по остаткам Y705 и S727, что приводит к его димеризации и связыванию с регулируемым STAT3 супрессором передачи сигналов цитокинов (SOCS3). Это активирует транскрипцию гена SOCS3, который, как известно, связан с усиленным ответом Th2-типа при астме. Совпадающее связывание SETD7 диметилатов STAT3 по K140. Это метилирование лизина связанного с промотором STAT3 является негативным регуляторным событием. Это препятствует способности STAT3 активировать SOCS3 в ответ на IL-6 и, следовательно, приводит к биологически важному подавлению ответа Th2. М, метилирование Р, фосфорилирование.

Известно, что ряд модификаций гистонов играет фундаментальную роль при раке (41), неврологических (42) и аутоиммунных заболеваниях (43, 44) и в управлении клеточным развитием (45). Что менее хорошо изучено при этих заболеваниях, как при астме, так это кумулятивном воздействии всех модификаций гистонов. Совместными усилиями Консорциума по эпигеномике дорожной карты национальных институтов здравоохранения (46) и Энциклопедии элементов ДНК (ENCODE) недавно были предприняты усилия по созданию обширных наборов данных для решения этой проблемы и предотвращения несоответствий в данных путем предоставления оптимизированных протоколов. Система регуляции гистонов не так проста, как активация против репрессии. Хотя в большинстве случаев гиперацетилирование и гипометилирование благоприятствуют транскрипционно активному хроматину и наоборот - транскрипционно неактивному хроматину, это не всегда так. Еще больше усложняют роль модификаций гистонов комбинации колокализованных (СНГ) гистоновые PTM на одном и том же гистоне, соседних (транс) гистоны в одной и той же нуклеосоме и региональные модификации между нуклеосомами вдоль нити хроматина, которые могут производить сложные сигналы и перекрестные взаимодействия для прямого ремоделирования хроматина. Комбинация ряда модификаций mono, di и tri, которые могут находиться на нескольких остатках по всему хроматиновому ландшафту, дополнительно усложняет то, что появилось как «гистоновый код» (Figure 2) (47). Вокруг этого термина ведутся споры, поскольку он не является точным предсказателем результатов, как генетический код. Например, совместная локализация H3K4me3 и H3K27me3 проявляет как активирующие, так и репрессивные свойства, создавая двухвалентное состояние хроматина, при котором гены готовы к быстрой активации. Это играет важную роль в развитии и дифференциации (48). Присутствие ранее существовавшей модификации может предотвратить модификацию других остатков, однако полная степень взаимодействия между модификациями неизвестна. Подробный обзор перекрестной регуляции модификаций гистонов при формировании гистонового кода представлен в другом месте (21).

В настоящее время ведутся исследования механизмов, лежащих в основе эпигенетической регуляции экспрессии генов, включая изучение PTM гистонового хвоста и его влияния на ремоделирование хроматина и экспрессию генов. Модифицирующие гистоны ферменты, регулирующие ПТМ в геноме, были описаны как «регуляторы решений, связанных с развитием, и движущие силы болезней человека» (45). Хотя гистоновые PTM не изменяют нуклеотидные последовательности, мутации в последовательностях активных ферментов могут влиять на то, как, что, где и когда происходит модификация экспрессии генов. Оценка мутаций фермента гистона PTM при заболевании требует внимания к взаимодействию между мутациями генов фермента, хроматином и экспрессией генов и последующим последующим влиянием на пути заболевания.

Астма классически характеризуется асимметричной активацией наивных CD4 + Т-клеток для дифференциации на подгруппы Th, которые вызывают заболевание. Подмножества линии Th-клеток, Th2 и Th17, секретируют цитокины, отличные от Th1 или Т-регуляторных (Treg) клеток. Эпигенетические механизмы (такие как модификация гистонов) регулируют антигенпрезентирующие дендритные клетки (DCs) (49-51) и обязательство клеточного клона T-клеток (22, 30, 31, 52-54) (Table 1, Figure 4). Активирующая модификация H3K4me3 контрастирует с H3K27me3, сайтом супрессивного метилирования, участвующим в сайленсинге генов, а не в экспрессии генов (25, 55). Модификации на этих участках влияют на дифференцировку и функцию происходящих из моноцитов ДК как в условиях опухоли, так и в условиях воспаления (49). ДК могут дифференцироваться либо в активированное, либо в толеризованное состояние и претерпевать сложный процесс созревания и миграции в региональные лимфатические узлы, чтобы активировать резидентные наивные Т-клетки для ответа на антиген (52). Сайты H3K4me3 и H3K27me3 характеризуют экспрессию генов ДК, происходящих из моноцитов, в условиях воспаления, когда они переходят от незрелых к зрелым антигенпрезентирующим клеткам (рис. 4). Совместная локализация этих двухвалентных гистоновых PTM приводит к двухвалентному состоянию с динамической регуляцией ключевых костимулирующих молекул DC, CD14, CD83 и CD86, а также лейкоцитарного антигена человека (HLA) -DRB1, факторов транскрипции семейства NF-κB и других цитокинов. , хемокины и их рецепторы. Эти генные продукты определяют способность DC адекватно реагировать и взаимодействовать с костимулирующими молекулами, важными для связи с Т-клетками и патогенеза астмы. Когда DC активируются LPS или толерантны путем трансформации фактора роста-β (вызывая ответ Th2 или Treg), H3K27me3 и H3K4me3 по-разному расположены вокруг этих важных генов, потенциально определяя воспалительное состояние (49).

Таблица 1. Исследования модификаций гистонов, связанных с патологиями Т-клеток и дендритных клеток, связанных с астмой

Определение сокращений: CXCR4, хемокин (мотив CXC), лиганд 4 DC, дендритная клетка Ezh, энхансер гомолога цесте GM-CSF, фактор H3K, стимулирующий колонии гранулоцитов / макрофагов, гистон-3-лизин HDAC, гистондеацетилаза KDM6A, лизин-специфическая деметилаза 6 , линкер для активации Т-клеток ORMDL3, оросомукоидный 1-подобный белок 3 PBMC, мононуклеарные клетки периферической крови PTM, посттрансляционная модификация Sirt1, сиртуин 1 SUV39H1, супрессор вариегации 3–9 гомолога Th, Т-хелпер.

Рисунок 4. Задокументированная роль модификаций гистонов и астмы, рассмотренная в этой статье, в исследованиях на людях и мышах. Из-за природы выступающего хвоста гистона 3 он наиболее легко модифицируется и, таким образом, легче всего изучается. Этот рисунок демонстрирует некоторые из наших текущих знаний о роли этих ферментов и остатков H3, которые они модифицируют, в патологии астмы. Зеленые стрелки указывают на стимулирующее, тогда как красные линии, заканчивающиеся полосой указывают на отрицательное регулирование. Ряд модификаций гистонов (видеть основной текст для подробного объяснения) способны влиять на активацию дендритных клеток и способствовать развитию и инфильтрации иммунных клеток Th2 и Th17, характерных для воспаления астмы. Клетки Th2 продуцируют ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9 и ИЛ-13, что приводит к привлечению эозинофилов, переключению IgE в В-клетках, гиперсекреции слизи и ремоделированию стенки дыхательных путей. IgE-активированные тучные клетки дегранулируют, высвобождая больше IL-5 и других провоспалительных медиаторов, что приводит к дополнительной инфильтрации эозинофилов и других иммунных клеток, способствуя воспалению дыхательных путей. Клетки Th17 продуцируют IL-17, который, по-видимому, специфически связан с инфильтрацией нейтрофилов и ремоделированием тканей, которые характеризуют тяжелую астму. Ezh, энхансер гомолога zeste HDAC, гистондеацетилаза Sirt1, сиртуин 1 SUV39H1, супрессор гомолога пестролистности 3–9.

Подтипы Т-клеток влияют на иммунные ответы при астме, где может усиливаться ответ Th2 или Th17 (1). Фенотипы клеток Th2 одинаково обладают значительной пластичностью: одна популяция продуцирует IL-5, а другая - нет. IL-5 играет роль в активации В-клеток, а также в пролиферации и дифференцировке эозинофилов (56), и в настоящее время он используется для лечения астмы. Отбор клеток Th2 с различающейся экспрессией IL-5 связан с различиями в активных PTM гистонов H3K4me3 и репрессивных H3K27me3, которые колокализируются вокруг промотора гена IL-5 (57). Картирование различных местоположений этих сайтов у мышей между Th1, Th2, Th17, индуцированными вызовами Treg и естественными Treg-клетками помогло определить, как эти двухвалентные модификации могут уравновешивать гены развития для активации или репрессии во время дифференцировки клеток, при этом отмечены некоторые уникальные закономерности (рис. 4) (54).

Многочисленные модификации гистонов и ассоциированные ферменты имеют отношение к функции DC, сенсибилизации и ответу Т-клеток. Ацетилирование гистонов является активирующей модификацией, и ферменты деацетилирования гистонов были нацелены на ингибирование или модуляцию поведения DC путем регулирования нижестоящих компонентов сигнальных путей, таких как NF-κB (50). Одним из таких ферментов является сиртуин 1 (Sirt1), гистоновая деацетилаза, которая выступает в качестве критического воспалительного регулятора как для астматического Т-клеточного иммунитета, так и для активации макрофагов, а в последнее время - для активации Т-клеток под контролем ДК (рис. 4). Sirt1 программирует ДК для презентации антигена и регулирования дифференцировки Т-клеток, благоприятствуя пути Th17 во время воспаления (51). Ингибирование Sirt1 на мышиной модели имитирует астматический воспалительный ответ (58). Кроме того, усиление экспрессии гена Sirt1 с помощью специфического активатора (SRT1720) подавляет воспаление (59) за счет снижения эозинофилов и провоспалительных цитокинов в бронхоальвеолярной жидкости (60).

Объединяющей темой гистоновых ПТМ в болезненных состояниях является их влияние на фенотипическую пластичность клеток и их способность адекватно реагировать на внешние или внутренние раздражители. Исследования ацетилирования гистонов, влияющих на устойчивость к кортикостероидам у субъектов с тяжелой астмой, показывают прямую корреляцию между активностью HDAC, которая, как известно, участвует в регуляции выработки цитокинов Th1 и Th2 (61), и нечувствительностью к стероидам (62). У некоторых субъектов с тяжелой астмой их мононуклеарные клетки периферической крови теряют фенотипическую пластичность, неспособны должным образом реагировать на кортикостероиды и уменьшать астматические симптомы и обострения. Эта неспособность реагировать на ингаляционные кортикостероиды является следствием аберрантного колониестимулирующего фактора гранулоцитов / макрофагов и высвобождения воспалительных цитокинов IFN-γ, частично из-за дефектов в ферментах модификации гистонов, вызывающих дисбаланс деацетилазы и ацетилтрансферазы (62).

Соотношение гистондеацетилазы и гистонацетилтрансферазы зависит от тяжести и физиологической интенсивности гиперреактивности бронхов у детей с атопической астмой. У этих пациентов наблюдается значительное снижение HDAC и повышение активности гистонацетилтрансферазы (63). Это снижение экспрессии / активности HDAC также отражается у взрослых с тяжелой, но не легкой формой астмы (62). Восстановление равновесия ацетилирования относительно деацетилирования может быть полезным, но остается возможным, что статус ацетилирования гистонов может быть результатом, а не причиной гиперчувствительности бронхов. Активность HDAC также объясняется устойчивостью фибробластов легких к апоптотическим фиброзным заболеваниям легких, таким как интерстициальный фиброз легких, хроническая обструктивная болезнь легких и астма.

Влияние эпигенетических модификаций на астму зависит от типа клеток. Например, если модификации происходят в клетках CD8 +, которые являются долгоживущими клетками, они, вероятно, будут влиять на фенотип астмы больше, чем ДК с коротким периодом полураспада. Было показано, что модификации гистонов играют важную роль в дифференцировке клеток CD4 + и CD8 + (30, 64), формируя профили транскрипции этих клеток и тем самым влияя на функцию (65). Также было показано, что эпигенетические механизмы влияют на дифференцировку и функцию DC, при этом одно исследование показало, что окисленные фосфолипиды, которые образуются во время воспалительных реакций, нарушают регуляцию дифференцировки DC (66). Эти примеры демонстрируют важность различения типов клеток при изучении эпигенетических модификаций.

Гистоновые ПТМ могут быть продуктом или фактором генетических факторов и факторов окружающей среды, связанных с астмой. Существует все большее согласие с тем, что модификации гистонов играют центральную роль в иммунных ответах при астме, но роль и функции модификаций гистонов далеки от понимания, и они выиграют от дальнейших исследований на астматических моделях, поскольку большая часть наших знаний на сегодняшний день собрана из исследований рака. . Необходимы исследования, объединяющие данные о глобальных клеточных функциях, модификациях гистонов, связывании факторов транскрипции и результирующих изменениях экспрессии генов. Не менее важно, чтобы дальнейшие исследования основывались на большей фенотипической точности и более точных данных о влиянии факторов окружающей среды. Строгое разделение на фенотипические группы, как клинические, так и молекулярные, позволит выявить микромеханизмы патологий астмы, а изучение условий окружающей среды и стимулирующих условий, окружающей последовательности ДНК и задействованных ферментов позволит лучше понять факторы окружающей среды и задействованные молекулярные пути. В совокупности это должно привести к открытию терапевтических целей для вмешательства.

На клеточном уровне, чтобы гистоновые PTM были жизнеспособной терапевтической мишенью, необходимы подробные исследования для характеристики PTM, специфичных для типов астматических клеток, особенно в ответ на астматические стимулы, и для определения последующей приверженности клонов Th-клеток. Роль гистоновых кодов в клеточной дифференцировке и биологии стволовых клеток также необходимо изучить, уделяя особое внимание дифференцировке стволовых клеток, DC, эозинофилов, T- и B-клеток, эпителиальных клеток дыхательных путей и других ключевых типов клеток, участвующих в развитии астмы. . Следует учитывать периоды полужизни клеток, поскольку точность приобретенных модификаций гистонов посредством деления клеток все еще плохо изучена. Клетки-предшественники, такие как миелоидные клетки костного мозга, которые дифференцируются в эозинофилы, нейтрофилы, моноциты, макрофаги и ДК, а также стволовые клетки легких, необходимо анализировать на протяжении всей дифференцировки, чтобы обнаружить поэтапные изменения в структуре гистонов. модификации, которые могут способствовать развитию патологий астмы.

Исторически сложилось так, что исследования астмы были сосредоточены на продуктах одного гена и их вкладе в патогенез, тогда как гистоновые ПТМ и их последующее влияние на мириады генов могут генерировать многие из наблюдений, описанных при астме. Достижения в области технологий позволили применять микроматрицы и платформы секвенирования нового поколения для анализа и визуализации модификаций всего генома и их влияния на экспрессию генов (14). Будущие исследования модификаций гистонов при астме должны быть сосредоточены на развитии более глубокого понимания гистонового кода путем картирования сложных взаимодействий и раскрытия молекулярных механизмов. Используемые в настоящее время аналитические методы, такие как иммунопреципитация хроматина и высокопроизводительное секвенирование, оптимизированы для работы с популяциями клеток 5000–10 000, однако методы визуализации живых клеток, специфичные для локусов, находятся в стадии разработки, такие как хроматин. in vivo Анализы открывают захватывающие возможности для будущего анализа отдельных клеток (67, 68).

Роль модификаций гистонов при тяжелой астме и то, как они влияют на реакцию на лечение, является еще одним важным направлением исследований, особенно потому, что эти пациенты имеют значительную заболеваемость в результате их плохой реакции на традиционные методы лечения, такие как кортикостероиды. Наконец, исследования, изучающие роль гистон-модифицирующих ферментов в других сигнальных путях, перекрестную связь между различными модификациями, их взаимосвязь с факторами транскрипции и роль генетического импринтинга, дополнят наше понимание механизмов, участвующих в патогенезе астмы и тяжесть астмы, что, в свою очередь, должно привести к более эффективным методам лечения.

Гистоновые ПТМ представляют собой эпигенетические механизмы, способные регулировать важные генетические компоненты астмы посредством сложной системы перекрестных помех, передачи сигналов и ремоделирования хроматина. Гистоновые ПТМ и связанные с ними ферменты оказывают значительное влияние на ответы Т-клеток, созревание ДК и реакции на лечение. Исследования в этой области создадут многообещающие цели для будущих методов лечения. Это уже касается лечения рака (69) и других заболеваний (70). Особенно заметны успехи в использовании низкомолекулярных ингибиторов (71), а также некоторые захватывающие недавние открытия взаимодействий с гистоновыми метилтрансферазами SETD7 и Ezh2 для нацеливания на рак, которые сейчас проходят клинические испытания (72). На сегодняшний день в центре внимания находится статус ацетилирования гистонов, при этом наблюдаются некоторые параллели в роли этих ферментов в других воспалительных заболеваниях и астме. Аналогичные направления исследований должны быть направлены на изучение терапевтических возможностей, предлагаемых конкретными ферментами модификации гистонов. ПТМ и его регуляция лежат на стыке между генетическими, экологическими и эпигенетическими факторами, способствующими заболеванию. При соответствующем манипулировании ферментами, которые модифицируют PTM комплекса гистоновых октамеров, мы получаем доступ к мощному инструменту, который может регулировать более широкую экспрессию воспалительных генов при астме.


Биологические функции

Регулирование транскрипции

Открытие ацетилирования гистонов, вызывающего изменения в транскрипционной активности, можно проследить до работы Vicent Allfrey и его коллег в 1964 году. [13] Группа предположила, что гистоновые белки, модифицированные ацетильными группами, добавляют отрицательные заряды к положительным лизинам и, таким образом, уменьшают их количество. взаимодействие между ДНК и гистонами. [14] Модификация гистона в настоящее время считается основным регуляторным механизмом, который участвует во многих различных стадиях генетических функций. [15] В настоящее время мы понимаем, что остатки ацетилированного лизина на гистоновых хвостах связаны с активацией транскрипции. В свою очередь, деацетилированные гистоны связаны с репрессией транскрипции. Кроме того, были обнаружены отрицательные корреляции между несколькими метками ацетилирования гистонов. [16]

Считается, что регуляторный механизм имеет двоякий характер. Лизин - это аминокислота с положительным зарядом в неизмененном виде. Лизины на аминоконцевых хвостах гистонов имеют тенденцию ослаблять общую структуру хроматина. Добавление ацетильной группы, которая несет отрицательный заряд, эффективно удаляет положительный заряд и, следовательно, уменьшает взаимодействие между гистоновым хвостом и нуклеосомой. [17] Это открывает обычно плотно упакованную нуклеосому и позволяет аппарату транскрипции вступать в контакт с матрицей ДНК, что приводит к транскрипции гена. [18] Подавление транскрипции генов достигается обратным этому механизму. Ацетильная группа удаляется одним из ферментов HDAC во время деацетилирования, позволяя гистонам более тесно взаимодействовать с ДНК с образованием компактированной сборки нуклеосом. Это увеличение жесткой структуры предотвращает включение транскрипционного аппарата, эффективно подавляя транскрипцию генов.

Другое значение ацетилирования гистонов - обеспечение платформы для связывания с белками. В качестве посттрансляционной модификации ацетилирование гистонов может привлекать белки к удлиненному хроматину, который был помечен ацетильными группами. Было высказано предположение, что гистоновые хвосты предлагают сайты узнавания, которые привлекают белки, ответственные за активацию транскрипции. [19] В отличие от белков гистонового ядра, гистоновые хвосты не являются частью ядра нуклеосомы и подвергаются взаимодействию с белками. Модель предполагает, что ацетилирование гистонов H3 активирует транскрипцию генов, привлекая другие комплексы, связанные с транскрипцией. Следовательно, ацетильная метка обеспечивает сайт узнавания белка, где факторы транскрипции взаимодействуют с ацетилированными гистоновыми хвостами через свой бромодомен. [20]

Гипотеза гистонового кода

Гипотеза гистонового кода предполагает идею, что паттерны посттрансляционных модификаций гистонов в совокупности могут управлять специфическими клеточными функциями. [21] Химические модификации гистоновых белков часто происходят на определенных аминокислотах. Это специфическое добавление одной или нескольких модификаций к ядрам гистонов может быть интерпретировано факторами транскрипции и комплексами, что приводит к функциональным последствиям. Этому процессу способствуют такие ферменты, как HAT и HDAC, которые добавляют или удаляют модификации гистонов, и факторы транскрипции, которые обрабатывают и «считывают» коды модификации. Результатом может быть активация транскрипции или репрессия гена. Например, комбинация ацетилирования и фосфорилирования оказывает синергетическое действие на общий уровень структурной конденсации хромосом и, следовательно, индуцирует активацию транскрипции непосредственно раннего гена. [22]

Эксперименты по изучению паттернов ацетилирования гистонов H4 показали, что эти паттерны модификации коллективно поддерживаются в митозе и мейозе, чтобы изменить долгосрочную экспрессию генов. [8] Паттерн ацетилирования регулируется ферментами HAT и HADC и, в свою очередь, устанавливает локальную структуру хроматина. Таким образом, паттерны ацетилирования передаются и взаимосвязаны со способностью связывания белков и функциями в последующем поколении клеток.

Бромодомен

Бромодомен - это мотив, который отвечает за распознавание ацетилированного лизина на гистонах с помощью белков ремоделирования нуклеосом. Посттрансляционные модификации N- и C-концевых гистоновых хвостов привлекают к промотору различные факторы инициации транскрипции, которые содержат бромодомены, включая коактиватор транскрипции человека PCAF, TAF1, GCN5 и CREB-связывающий белок (CBP), и имеют значение в регуляции экспрессии генов. [23] Структурный анализ факторов транскрипции показал, что высококонсервативные бромодомены необходимы для связывания белка с ацетилированным лизином. Это предполагает, что специфическое ацетилирование гистонового сайта играет регулирующую роль в активации транскрипции генов. [24]


Ферменты ацетилирования / деацетилирования гистонов

Гистонацетилтрансфераза (HAT)

Гистоновые ацетилтрансферазы, также известные как HAT, представляют собой семейство ферментов, которые ацетилируют гистоновые хвосты нуклеосомы. Эта и другие модификации выражаются в зависимости от различных состояний клеточной среды. [2] Многие белки, обладающие способностью к ацетилированию, были задокументированы и со временем были классифицированы на основе сходства последовательностей между ними. Эти сходства высоки среди членов семьи, но члены из разных семей очень мало похожи. [9] Некоторые из основных семейств, идентифицированных на данный момент, следующие.

Семья GNAT

Общий контроль Недерепрессируемые 5 (Gcn5) -зависимые N-ацетилтрансферазы (GNAT) являются одним из многих изученных семейств со способностями к ацетилированию. [10] Это суперсемейство включает факторы Gcn5, которые входят в комплексы SAGA, SLIK, STAGA, ADA и A2, Gcn5L, фактор, связанный с p300 / CREB-связывающим белком (PCAF), Elp3, HPA2 и HAT1. [10] [11] Основные особенности семейства GNAT включают домены HAT длиной примерно 160 остатков и консервативный бромодомен, который, как было обнаружено, является направленным на ацетил-лизин мотивом. [9] Было показано, что Gcn5 ацетилирует субстраты, когда он является частью комплекса. [11] Было обнаружено, что рекомбинантный Gcn5 участвует в ацетилировании гистонов H3 нуклеосомы. [2] [11] В меньшей степени было обнаружено, что он также ацетилирует гистоны H2B и H4 при взаимодействии с другими комплексами. [2] [3] [11] PCAF обладает способностью действовать как белок HAT и ацетилировать гистоны, он может ацетилировать негистоновые белки, связанные с транскрипцией, а также действовать как коактиватор во многих процессах, включая миогенез, ядерный рецептор -опосредованная активация и активация, сигнализируемая факторами роста. Elp3 обладает способностью ацетилировать все гистоновые субъединицы, а также участвует в холоферменте РНК-полимеразы II. [2]

Семья MYST

MOZ (цинковый белок пальца при моноцитарном лейкозе), Ybf2 / Sas3, Sas2 и Tip60 (белок, взаимодействующий с Tat) составляют MYST, еще одно хорошо известное семейство, которое проявляет способность к ацетилированию. Это семейство включает Sas3, важную SAS-родственную ацетилтрансферазу (Esa1), Sas2, Tip60, MOF, MOZ, MORF и HBO1. Члены этого семейства выполняют множество функций, не только активируя и подавляя гены, но также влияют на развитие и имеют значение при заболеваниях человека. [11] Sas2 и Sas3 участвуют в подавлении транскрипции, MOZ и TIF2 участвуют в образовании продуктов лейкемической трансклокации, тогда как MOF участвует в дозовой компенсации у Drosophila. Домены HAT для этого семейства состоят примерно из 250 остатков, которые включают богатые цистеином цинк-связывающие домены, а также N-концевые хромодомены. Белки MYST Esa1, Sas2 и Sas3 обнаружены в дрожжах, MOF обнаружены у Drosophila, а Tip60, MOZ, MORF и HBO1 обнаружены у людей. [9] Tip60 играет роль в регуляции транскрипции генов, было обнаружено, что HBO влияет на процесс репликации ДНК, MORF способен ацетилировать свободные гистоны (особенно H3 и H4), а также нуклеосомные гистоны. [2]

Семейство p300 / CBP

Аденовирусный E1A-ассоциированный белок 300 кДа (p300) и CREB-связывающий белок (CBP) составляют следующее семейство HAT. [10] Это семейство HAT содержит домены HAT длиной примерно 500 остатков и бромодомены, а также три домена, богатых цистеином и гистидином, которые помогают во взаимодействии с белками. [9] Эти HAT, как известно, ацетилируют все гистоновые субъединицы в нуклеосоме. Они также обладают способностью ацетилировать и опосредовать негистоновые белки, участвующие в транскрипции, а также участвуют в клеточном цикле, дифференцировке и апоптозе. [2]

Другие шляпы

Есть и другие белки, которые обладают способностью к ацетилированию, но отличаются по структуре от ранее упомянутых семейств. Один HAT называется коактиватором стероидного рецептора 1 (SRC1), который имеет домен HAT, расположенный на С-конце белка, вместе с основной спиралью-петлей-спиралью и доменами PAS A и PAS B с мотивом, взаимодействующим с рецептором LXXLL в середина. Другой - ATF-2, который содержит домен активации транскрипции (ACT) и основной ДНК-связывающий домен «застежки-молнии» (bZip) с промежуточным доменом HAT. Последним является TAFII250, который имеет киназный домен в N-концевой области, два бромодомена, расположенные в C-концевой области, и домен HAT, расположенный между ними. [12]

Гистоновая деацетилаза (HDAC)

Всего существует четыре класса гистоновых деацетилаз (HDAC). Класс I включает HDAC 1, 2, 3 и 8. Класс II делится на две подгруппы: класс IIA и класс IIB. Класс IIA включает HDAC 4, 5, 7 и 9, тогда как класс IIB включает HDAC 6 и 10. Класс III содержит сиртуины, а класс IV содержит только HDAC11. [5] [6] Классы белков HDAC разделены и сгруппированы на основании сравнения с гомологиями последовательностей Rpd3, Hos1 и Hos2 для HDAC класса I, HDA1 и Hos3 для HDAC класса II и сиртуинов для HDAC класса III. [6]

HDAC класса I

HDAC1 и amp HDAC2

HDAC1 и amp HDAC2 относятся к первому классу HDAC и наиболее тесно связаны друг с другом. [5] [6] Анализируя общие последовательности обоих HDAC, было обнаружено, что их сходство примерно на 82% гомологично. [5] Эти ферменты оказались неактивными при выделении, что привело к заключению, что они должны быть включены с кофакторами, чтобы активировать их деацетилазные способности. [5] Существует три основных белковых комплекса, в которые могут встраиваться HDAC 1 и amp 2. Эти комплексы включают Sin3 (названный в честь его характерного белка mSin3A), комплекс ремоделирования и деацетилирования нуклеосом (NuRD) и Co-REST. [5] [6] Комплекс Sin3 и комплекс NuRD оба содержат HDAC 1 и 2, Rb-ассоциированный белок 48 (RbAp48) и RbAp46, которые составляют ядро ​​каждого комплекса. [2] [6] Однако могут потребоваться другие комплексы, чтобы инициировать максимально возможное количество доступной активности. HDAC 1 и 2 могут также напрямую связываться с ДНК-связывающими белками, такими как Yin и Yang 1 (YY1), Rb-связывающим белком 1 и Sp1. [5] Было обнаружено, что HDACs 1 и 2 экспрессируют регуляторные роли в ключевых генах клеточного цикла, включая p21. [6]

На активность этих HDAC может влиять фосфорилирование. Повышенное количество фосфорилирования (гиперфосфорилирование) приводит к увеличению активности деацетилазы, но ухудшает образование комплексов между HDAC 1 и 2 и между HDAC1 и mSin3A / YY1. Более низкое, чем обычно, количество фосфорилирования (гипофосфорилирование) приводит к снижению количества активности деацетилазы, но увеличивает количество комплексообразования. Исследования мутаций показали, что основное фосфорилирование происходит по остаткам Ser 421 и Ser 423. Действительно, когда эти остатки были мутированы, наблюдалось резкое снижение активности деацетилирования. [5] Это различие в состоянии фосфорилирования является способом поддержания оптимального уровня фосфорилирования, чтобы гарантировать отсутствие избыточной или недостаточной экспрессии деацетилирования. HDAC 1 и 2 были обнаружены только в ядре. [2] [6] У мышей с нокаутом HDAC1 (KO) было обнаружено, что мыши умирают во время эмбриогенеза и демонстрируют резкое снижение продукции, но повышенную экспрессию ингибиторов циклин-зависимых киназ (CDKI) p21 и p27. Даже повышающая регуляция других HDAC класса I не могла компенсировать потерю HDAC1. Эта неспособность оправиться от HDAC1 KO заставляет исследователей полагать, что существует как функциональная уникальность каждого HDAC, так и регулятивная перекрестная связь между факторами. [6]

HDAC3

Было обнаружено, что HDAC3 наиболее близок к HDAC8. HDAC3 содержит неконсервативную область в C-концевой области, которая, как было обнаружено, необходима для репрессии транскрипции, а также для его деацетилазной активности. Он также содержит две области, одну из которых называют сигналом ядерной локализации (NLS), а также сигналом ядерного экспорта (NES). NLS функционирует как сигнал к ядерному действию, в то время как NES функционирует с HDAC, которые выполняют работу вне ядра. Наличие обоих сигналов для HDAC3 предполагает, что он перемещается между ядром и цтиоплазмой. [5] Было даже обнаружено, что HDAC3 взаимодействует с плазматической мембраной. [6] Медиатор подавления рецепторов ретиноевой кислоты и гормонов щитовидной железы (SMRT) и факторы ко-репрессора ядерного рецептора (N-CoR) должны использоваться HDAC3 для его активации. [5] [6] При этом он приобретает способность ко-преципитировать с HDAC 4, 5 и 7. HDAC3 также может быть обнаружен в комплексе с HDAC-родственным белком (HDRP). [5] Было обнаружено, что HDACs 1 и 3 опосредуют взаимодействия Rb-RbAp48, что позволяет предположить, что они участвуют в развитии клеточного цикла. [5] [6] HDAC3 также демонстрирует участие в самообновлении стволовых клеток и независимую от транскрипции роль в митозе. [6]

HDAC8

Было обнаружено, что HDAC8 наиболее похож на HDAC3. Его главной особенностью является его каталитический домен, который содержит NLS-область в центре. Были обнаружены две транскрипции этого HDAC, которые включают транскрипт 2,0 КБ и транскрипт 2,4 КБ. [5] В отличие от других молекул HDAC, при очистке этот HDAC оказался ферментативно активным. [6] На данный момент, в связи с его недавним открытием, еще не известно, регулируется ли он с помощью корепрессорных белковых комплексов. Нозерн-блоттинг показал, что разные типы тканей демонстрируют разную степень экспрессии HDAC8 [5], но наблюдаются в гладких мышцах и, как полагают, вносят вклад в сократимость. [6]

HDAC класса II

Класс IIA

HDAC класса IIA включает HDAC4, HDAC5, HDAC7 и HDAC9. Было обнаружено, что HDAC 4 и 5 наиболее похожи друг на друга, в то время как HDAC7 сохраняет сходство с ними обоими. Было обнаружено три варианта HDAC9, включая HDAC9a, HDAC9b и HDAC9c / HDRP, хотя подозреваются и другие. Было обнаружено, что варианты HDAC9 имеют сходство с остальными HDAC класса IIA. Для HDAC9 варианты сплайсинга можно рассматривать как способ создания «тонко настроенного механизма» для уровней экспрессии дифференцировки в клетке. Различные типы клеток могут использовать преимущества и использовать разные изоформы фермента HDAC9, обеспечивая различные формы регуляции. HDACs 4, 5 и 7 имеют свои каталитические домены, расположенные на C-конце вместе с областью NLS, тогда как HDAC9 имеет свой каталитический домен, расположенный на N-конце. Однако вариант HDAC9 HDAC9c / HDRP не имеет каталитического домена, но имеет 50% сходство с N-концом HDAC 4 и 5. [5]

Для HDAC 4, 5 и 7 были обнаружены консервативные связывающие домены, которые связываются с C-концевым связывающим белком (CtBP), фактором усиления миоцитов 2 (MEF2) и 14-3-3. [5] [6] Все три HDAC работают, чтобы подавить миогенный фактор транскрипции MEF2, который играет важную роль в дифференцировке мышц в качестве ДНК-связывающего фактора транскрипции. Связывание HDAC с MEF2 ингибирует дифференцировку мышц, которая может быть обращена действием Ca 2+ / кальмодулин-зависимой киназы (CaMK), которая работает для диссоциации комплекса HDAC / MEF2 путем фосфорилирования части HDAC. [5] Было замечено, что они участвуют в клеточной гипертрофии в дифференцировке мышечного контроля, а также в клеточной гипертрофии в мышечной и хрящевой тканях. [6] HDACs 5 и 7, как было показано, работают против HDAC4 во время регуляции дифференцировки мышц, чтобы поддерживать надлежащий уровень экспрессии. Было доказано, что эти HDACs также взаимодействуют с HDAC3 как фактор совместного рекрутирования для факторов SMRT / N-CoR в ядре. Было показано, что отсутствие фермента HDAC3 приводит к неактивности, что заставляет исследователей полагать, что HDAC 4, 5 и 7 способствуют включению ДНК-связывающих рекрутеров для HDAC3-содержащих комплексов HDAC, расположенных в ядре. [5] Когда у мышей нокаутируется HDAC4, они страдают от выраженной гипертрофии хондроцитов и умирают из-за сильной оссификации. Было показано, что HDAC7 подавляет Nur77-зависимый апоптоз. Это взаимодействие приводит к участию в клональной экспансии Т-клеток. Показано, что мыши HDAC9 KO страдают от гипертрофии сердца, которая усугубляется у мышей с двойным KO для HDAC 9 и 5. [6]

Класс IIB

HDAC класса IIB включают HDAC6 и HDAC10. Эти два HDAC наиболее тесно связаны друг с другом в общей последовательности. Однако каталитический домен HDAC6 больше всего похож на HDAC9. [5] Уникальной особенностью HDAC6 является то, что он содержит два каталитических домена, расположенных в тандеме друг с другом. [5] [6] Другой уникальной особенностью HDAC6 является домен цинкового пальца (HUB), связанный с HDAC6-, SP3 и Brap2, на С-конце, который демонстрирует некоторые функции, связанные с убиквитинированием, что означает, что этот HDAC склонен к деградации. [5] HDAC10 также имеет два каталитических домена. Один активный домен расположен на N-конце, а предполагаемый каталитический домен расположен на C-конце [5] [6] вместе с доменом NES. [5] Два предполагаемых Rb-связывающих домена также были обнаружены на HDAC10, что показывает, что он может играть роль в регуляции клеточного цикла. Обнаружены два варианта HDAC10, оба имеют небольшие различия в длине. HDAC6 - единственный HDAC, который, как было показано, действует на тубулин, действуя как деацетилаза тубулина, которая помогает в регуляции подвижности клеток, зависимой от микротрубочек. В основном он обнаруживается в цитоплазме, но, как известно, обнаруживается в ядре в комплексе с HDAC11. Было замечено, что HDAC10 действует на HDACs 1, 2, 3 (или SMRT), 4, 5 и 7. Было показано, что он может иметь небольшие взаимодействия с HDAC6. Это заставляет исследователей полагать, что HDAC10 может действовать скорее как рекрутер, чем как фактор деацетилирования. Однако эксперименты, проведенные с HDAC10, действительно показали активность деацетилирования. [5]

HDAC класса IV

HDAC11

Было показано, что HDAC11 связан с HDAC 3 и 8, но его общая последовательность сильно отличается от других HDAC, что делает его принадлежащим к отдельной категории. [5] [6] HDAC11 имеет каталитический домен, расположенный на его N-конце. Он не был обнаружен в составе каких-либо комплексов HDAC, таких как Nurd или SMRT, что означает, что он может иметь особую уникальную функцию. Было обнаружено, что HDAC11 остается в основном в ядре. [5]


Вручение премии Ричарда Лифтона

Само существование жизни кажется чудесным. Развитие одной клетки растения, насекомого или человека, каждая из которых содержит специализированные клетки и органы с совершенно разными функциями, представляет собой одну из великих загадок. Теперь мы понимаем, что все формы жизни на Земле используют информацию, закодированную в ДНК, в качестве инструкции по построению взрослого организма. Инструкции выполняются путем копирования сегментов ДНК, называемых генами, в копии РНК, которые направляют производство белков, которые создают мышечную клетку, клетку печени или нейрон. Для этого необходимо, чтобы разные наборы генов включались, выключались или настраивались на нужный уровень в разных типах клеток. Более того, экспрессия генов также должна модулироваться, чтобы реагировать на периодические изменения внешней среды.

Наше первое понимание того, как выборочно включаются и выключаются гены, было получено в результате исследований бактерий. Кишечная палочка Джейкобом и Моно в начале 1960-х. Они установили парадигму, согласно которой факторы транскрипции - белки, которые связываются со специфическими последовательностями ДНК, - способствуют или ингибируют копирование ДНК в РНК.

Больше информации

Тем не менее между бактериями и эукариотами, то есть растениями, животными и грибами, есть разительные различия. Например, геном человека почти в 1000 раз больше, чем Кишечная палочка. Расширенная ДНК одной клетки человека составляет 6 футов в длину, но сжата в ядро, имеющее радиус всего 3 микрона, что создает серьезную организационную / управленческую проблему. Хромосомная ДНК эукариот, но не бактерий, связана с семейством небольших белков, называемых гистонами. Исследования Роджера Корнберга, Тима Ричмонда и других показали, что этот ДНК-белковый комплекс состоит из цепочки гранул, называемых нуклеосомами, причем каждая гранула имеет ядро ​​из гистоновых белков с ДНК, обернутой вокруг. Эти шарики упакованы в сборки более высокого порядка в хромосомах, при этом длина волокон ДНК сжимается до 10 000 раз во время деления клетки.

Однородность гистоновых гранул и их отсутствие предпочтения конкретным последовательностям ДНК привели к широко распространенному предположению, что эти нуклеосомы были просто инертным упаковочным материалом для ДНК в ядре. Тем не менее в 1960-х Винсент Олфри сделал провокационное наблюдение, что гистоновые белки можно химически модифицировать. Он показал, что ацетилированные гистоны были обогащены в высоко экспрессируемых частях генома и истощены в сегментах, которые не экспрессируют гены. Однако доступные инструменты в то время не могли установить, была ли модификация гистонов причиной или следствием экспрессии генов, и эти наблюдения прекратились.

Вот Майкл Грюнштейн, который в 1980-х годах решил проверить идею о том, что гистоны играют активную роль в регуляции экспрессии генов. Он изучал пекарские дрожжи -С. cerevisiae- потому что этим одноклеточным грибом можно манипулировать генетически. Грюнштейн разработал дрожжи, в которых производство гистонов можно было включать и выключать по желанию. В 1987 году Грюнштейн и его коллеги сообщили, что отключение производства гистонов удивительным образом привело к истощению нуклеосом, они обнаружили, что это привело к активации экспрессии генов, которые обычно были отключены, что впервые указывает на то, что нуклеосомы регулируют экспрессию генов in vivo.

Затем он задал еще более амбициозный вопрос: изменяют ли специфические мутации ДНК, изменяющие гистоновые белки, экспрессию генов? В элегантной серии экспериментов он впервые показал, что удаление короткого отрезка одного из концов одного из гистоновых белков, называемого H4, выборочно устраняет индукцию экспрессии генов, которые сильно регулируются доступностью различных питательных веществ в окружающей среде. Важно отметить, что этот сегмент включал все четыре ацетилированных сайта белка. Затем он мутировал эти четыре сайта, чтобы они больше не могли быть ацетилированы, и показал, что этих мутаций было достаточно, чтобы предотвратить включение этих генов.

Напротив, Грюнштейн далее обнаружил мутации в гистоновых хвостах, которые включают экспрессию генов, предотвращая нормальное уплотнение хромосом в сильно конденсированные сегменты, называемые гетерохроматином, в которых экспрессия генов выключена. Он выяснил красивый биохимический механизм, показывающий, как этот гетерохроматин непрерывно распространяется по хромосоме, объяснив хорошо описанный, но загадочный феномен.

Новаторская работа Грюнштейна впервые установила причинную связь между изменениями определенных участков в гистоновых белках при нормальной активации и репрессии экспрессии генов.

Параллельно Дэвид Аллис использовал биохимию для выделения ферментов, которые опосредуют модификацию гистонов. Уровни этих ферментов в клетках были чрезвычайно низкими, что привело к тому, что Аллис обратился к Тетрахимена, необычное простейшее, у которого экспрессия генов происходит в ядрах, в которых хромосомная ДНК разбита на небольшие части размером с ген, которые затем амплифицируются до большого числа копий. Эти ядра имеют высокий уровень экспрессии генов с высоким уровнем ацетилирования гистонов. С помощью оригинального экспериментального подхода команда Аллиса в 1996 году очистила первую гистонацетилтрансферазу. Последовательность этого белка произвела впечатляющий сюрприз, показав, что он тесно связан с загадочным дрожжевым белком Gcn5p, который был идентифицирован как белок, который не связывает ДНК, но, тем не менее, необходим в качестве партнера для различных факторов транскрипции для включения. экспрессия сильно регулируемых генов. Вскоре команда Аллиса показала, что этот соактиватор дрожжей, как и его Тетрахимена аналог, селективно ацетилировал сайты в гистоновых хвостах, которые ацетилируются in vivo.

Эти исследования в совокупности вовлекли ковалентную модификацию гистоновых белков в нормальную регуляцию экспрессии генов и всколыхнули поле, привлекая большое количество талантливых ученых. В результате поток работ изменил наше понимание регулируемой экспрессии генов и выявил ранее неизвестный язык, на котором различные химические модификации конкретных сайтов в гистоновых белках имеют разные последствия. Например, ацетилирование в одном конкретном сайте способствует активации экспрессии гена, в то время как метилирование в том же сайте ингибирует экспрессию гена. Напротив, метилирование в другом сайте, работая через другой адаптерный белок, способствует активации экспрессии, а фосфорилирование еще одного сайта способствует крайнему уплотнению хромосом перед делением клетки. Аллис сыграл важную роль в открытии многих из этих модификаций гистонов и механизма их действия. Важно отметить, что эти химические модификации могут сохраняться, обеспечивая клеточную память, которая поддерживает дифференциацию типов клеток, и могут стимулировать определенные гены, которые были временно включены, например, в ответ на травму, чтобы быть готовыми к быстрой реактивации в случае травмы. тот же сайт повторяется.

Грюнштейн и Аллис сыграли ключевую роль в открытии этого надежного поля и сыграли непосредственную роль во многих из этих трансформационных открытий.

Важность этих модификаций гистонов со временем становится все более очевидной. Некоторые классические аномалии развития у плодовой мушки Drosophila, при которых одна часть тела трансформируется в другую, оказались вызваны мутациями, которые выводят из строя ферменты, модифицирующие гистоны. И в последние несколько лет эти открытия распространились на людей, где мутации в модификаторах гистонов и читателях этих модификаций являются наиболее частой причиной врожденных пороков развития, таких как врожденные пороки сердца, а также частой причиной аномалий развития нервной системы, таких как аутизм. Более того, соматические мутации в десятках различных модификаторов гистонов или в сайтах гистонов, которые они модифицируют, являются движущими силами широкого спектра рака. В одном поразительном примере педиатрические глиомы - разрушительный рак мозга - обычно связаны с единственной повторяющейся мутацией гистона в участке, обычно метилированном ферментом, модифицирующим гистоны. Команда Аллиса показала, что этот мутантный гистон прочно связывается со своим модифицирующим ферментом, изолируя его и мешая ему выполнять свою нормальную работу.

Вся эта работа стимулировала усилия по разработке новых терапевтических средств, нацеленных на эти модифицирующие гистоны ферменты, некоторые из которых сейчас используются в повседневной клинической практике, например, ингибиторы ферментов, которые удаляют ацетильные группы из гистонов, полезны при раке, включая кожную Т-клеточную лимфому. и множественная миелома, и многие другие находятся в клинических исследованиях по поводу различных заболеваний.

Открытия Грюнштейна и Аллиса были оригинальными и неожиданными, они изменили наше понимание регуляции экспрессии генов. Их работа была также смелой, они посвящали годы усилий, преодолевая сложные технические проблемы в своих исследовательских программах, одновременно плывя против сильного течения передовой области, которая не предусматривала необходимости роли гистоновых белков в регуляции генов. Кроме того, стоит отметить, что открытия Грюнштейна и Аллиса явились результатом их проницательного выбора простых экспериментальных систем для исследования - дрожжей и Тетрахимена. Такие простые системы позволили получить бесчисленное множество фундаментальных открытий в области биологии, напомнив нам, что общественная поддержка исследований, основанных на любопытстве, продолжает давать глубокие открытия, которые в конечном итоге влияют на наше понимание здоровья и болезней человека. Я рад поздравить Майкла и Дэвида с их выдающимися научными достижениями, которые они исключительно заслуживают присуждения Премии Альберта Ласкера в области фундаментальных медицинских исследований в этом году.


Вытеснение гистонов у промоторов Saccharomyces cerevisiae Гены теплового шока дифференциально связаны с ацетилированием гистона H3

ИНЖИР. 1. Кинетика замещения гистона H3 на промоторах гена теплового шока. (A) Смещение складки гистона H3 (у ось) с течением времени (от 0 до 64 мин) (Икс оси) относительно уровня без теплового шока (0 "), который был произвольно установлен на 1. Все значения ПЦР в реальном времени были нормализованы относительно PHO5 промотор, который, как известно, содержит позиционированные нуклеосомы, не меняющиеся при тепловом шоке (13). Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение (п ≥ 3). (B) Тот же эксперимент, что и в панели A, за исключением того, что ChIP были выполнены с антителом, индуцированным против ацетилированной формы H3. (C) Относительное изменение содержания ацетилированного H3 (AcH3) / H3 (у ось), рассчитанный по данным на панелях A и B. Содержание AcH3 / H3 = смещение H3 / потеря AcH3. (Примечание: величина смещения [потери] является обратной величиной численности.) ИНЖИР. 2. Кинетика замещения гистона H4 на промоторах гена теплового шока. Эксперимент проводили, как на рис. 1, за исключением того, что ChIP проводили с антителами против H4. Использовали штамм, экспрессирующий версию H4, меченную myc. (A) Замещение общего H4 (антитело против myc). (B) Потеря ацетилированного H4 (антитела против тетраацетила H4). (C) Изменение отношения ацетилированного H4 (AcH4) / общего H4, рассчитанное по данным панелей A и B, как описано в легенде на рис. ИНЖИР. 3. Кинетика ремоделирования хроматина на HSP12 промотор в штаммах, экспрессирующих разные версии HSF. Данные на панелях A, B и C представлены в том же формате, что и на рис. 1. Рисунки слева представляют карты конструкций HSF, экспрессируемых в четырех различных штаммах дрожжей. Примечание: выражение конструкций представляет собой единственный источник HSF. ИНЖИР. 4. Кинетика ремоделирования хроматина на HSP82 промотор в штаммах, экспрессирующих разные версии HSF. Данные на панелях A, B и C представлены в том же формате, что и на рис.1. ИНЖИР. 5. Кинетика ремоделирования хроматина на SSA4 промотор в штаммах, экспрессирующих разные версии HSF. Данные на панелях A, B и C представлены в том же формате, что и на рис.1. ИНЖИР. 6. Изобилие HSF дифференциально увеличивается на промоторах гена теплового шока при изменении температуры. (A) Изобилие HSF перед тепловым шоком у указанных промоторов. Сигналы ПЦР в реальном времени для образцов без шока были нормализованы до PHO5 и ввести. (B) Изменение численности HSF на HSP12 промотора во время теплового шока относительно уровня без теплового шока (0 '), который был произвольно установлен на 1. (C и D) Тот же эксперимент, что показан на панели B, за исключением того, что сигналы были получены для HSP82 а также SSA4 промоутеры соответственно. ИНЖИР. 7. Кинетика загрузки Pol II на промоторы гена теплового шока. Данные на панелях от A до D представлены в том же формате, что и на рис. 6, за исключением того, что вместо нормализации к PHO5 Нормализацию промотора проводили в межгенной области хромосомы V (последовательности праймеров см. в разделе «Материалы и методы»). ИНЖИР. 8. Резкое смещение гистонов во время активации генов теплового шока не всегда связано с надежным ацетилированием гистона H3. Молекулярная модель схематически представляет дифференциальные процессы на трех исследованных промоторах гена теплового шока при индукции транскрипции. Ацетилированные H3-обогащенные нуклеосомы в промежуточном состоянии на HSP12 а также HSP82 промоторы представлены фиолетовым цветом. Нуклеосомы с неацетилированным H3 показаны коричневым цветом. Неактивный HSF в неиндуцированном состоянии представлен синим, а активированный HSF показан красным. Промежуточные уровни загрузки HSF и Pol II представлены уменьшенными изображениями для соответствующих белков. Смещение гистона представлено уменьшением количества нуклеосом в промежуточном состоянии. Мультфильмы с промежуточным статусом примерно представляют ситуацию у промоутера после 2 минут теплового шока.

Вспомогательная информация

S1 Рис. Анализ уровня протеина ацетилтрансферазы.

Вестерн-блоттинг p300 (A) и PCAF (B) в экстрактах из клеток, обработанных PJ34 в течение 3 часов, по сравнению с необработанными клетками (NT). Гистограммы показывают уровень белка p300 и PCAF, нормализованный с помощью альфа-тубулина, из клеток, обработанных PJ34 в течение 3 часов (черный), по сравнению с необработанными клетками (NT, серый). Используемые антитела: мышиные моноклональные анти-KAT3B / p300 CT (Millipore, 05–257), кроличьи поликлональные анти-KAT2B / PCAF (abcam, ab12188) и крысиные моноклональные антитела против α тубулина (Santa Cruz Biotechnology, sc-53030). .

S2 Рис. Карта фрагментов промотора, используемых в анализах ChIP.

Для каждого гена указаны TSS (сайт начала транскрипции) и ATG.

S3 Рис. Анализ экспрессии PARG.

(A) кОТ-ПЦР Parg Уровень мРНК из клеток NIH3T3, обработанных PJ34 в течение указанного времени, по сравнению с необработанными клетками. Значения мРНК были нормализованы к средней экспрессии двух генов домашнего хозяйства, Gusb а также Hprt1. Зонды Taqman были: Mm00449466_m1 для Parg, Mm00446956_m1 для Gusb, и Mm00446968_m1 для Hprt1. Условия qRT-PCR были такими, как описано в Ciccarone et al., Plos One 2008. Столбики ошибок показывают стандартное отклонение данных, полученных в трех независимых экспериментах. (B) Вестерн-блоттинг экстрактов целых клеток из тех же клеток, что и в (A), проведенный на 8% SDS-PAGE и зондирование анти-PARG (Santa Cruz sc-21480), или анти-PAR, или анти-тубулином. антитела.

S4 Рис. Анализ глобального уровня ацетилирования гистонов в клетках L929 и N2a.

(A) Вестерн-блоттинг экстрактов целых клеток из клеток L929, обработанных ингибитором PJ34 (5 M) в течение 3 часов по сравнению с необработанными клетками (NT, значение

1), запустить 15% SDS-PAGE, зондировать анти-ацетил-гистон H3 или анти-C-концевой антител H3 для измерения относительного уровня ацетилирования H3. Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение данных, полученных в трех независимых экспериментах.(B) То же, что и в (A), но гибридизацию проводили с анти-ацетил-гистоном H4 или анти-C-концевым антителом H4 для измерения относительного уровня ацетилирования H4. (C) Те же экстракты, что и на панелях A и B, обрабатывали на 8% SDS-PAGE и зондировали антителом против PAR для визуализации уровня полимеров ADP-рибозы. Панели D, E и F: такие же, как в A, B и C, соответственно, но анализ проводился с экстрактами целых клеток из клеток нейробластомы N2a.

S5 Рис. Анализ глобального уровня ацетилирования гистона H3 при сверхэкспрессии CTCF.

(A) Вестерн-блоттинг общих белков из клеток, трансфицированных пустым вектором (pCI) или рекомбинантным CTCF с меткой His (pCI-CTCF-His, Guastafierro et al., J. Biol. Chem 2008), проведенный на 8% SDS-PAGE и зондировали антителом против PAR. (B) То же, что и в (A), но гибридизацию проводили с антителом против His для визуализации CTCF и с антителом против ламина B1 в качестве контроля загрузки белка. (C) Те же экстракты, что и на панели A и B, обрабатывали с помощью 15% SDS-PAGE и зондировали анти-ацетил-гистоном H3 и анти-C-концевыми антителами H3.

S6 Рис. Анализ глобального уровня ацетилирования гистонов в присутствии галлотаннина.

(A) Вестерн-блоттинг экстрактов целых клеток из клеток NIH 3T3, обработанных ингибитором PARG галлотаннином (Tannic Acid, Sigma) (30 M) в течение указанного времени относительно необработанных клеток (NT), проводят на 8% SDS-PAGE, и зондировали антителом против PAR для визуализации полимеров ADP-рибозы. (B) Те же экстракты, что и в (A), обрабатывали на 15% SDS-PAGE и зондировали анти-ацетил-гистоном H3 или анти-C-концевым антителом H3 для измерения относительного уровня ацетилирования H3. (C) То же, что и в (B), но гибридизацию проводили с анти-ацетил-гистоном H4 или анти-C-концевым антителом H4 для измерения относительного уровня ацетилирования H4.


Смотреть видео: Хромосомы, хроматиды, хроматин и. видео 12. Деление Клетки. Биология (August 2022).