Информация

Как белки мигрируют в MES по сравнению с MOPS

Как белки мигрируют в MES по сравнению с MOPS



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Мои гели выглядят значительно по-разному в MES (2- (N-морфолино) этансульфоновая кислота) и MOPS (3- (N-морфолино) пропансульфоновая кислота). Этого следовало ожидать. Я не понимаю, почему простое присутствие противоиона значительно изменяет скорость некоторых белков.

Это связано с разным pH (MES обычно работает при pH 8,0, MOPS обычно работает при pH 7,0) или за все отвечает распределение заряда на противоионе?


Что ж, чтобы рационализировать все комментарии, я думаю, что @leonardo прав.

Это денатурирующий гель SDA PAGE. Миграция отрицательно заряженных мицелл SDS зависит от экранирования раствора вокруг них. Разница в подвижности заключается в том, что мицеллы SDS будут испытывать немного другое поле при pH ~ 6,2 (MES) по сравнению с 7,2 (MOPS).

Мысль о том, что они имеют одинаковый заряд, была бы правильной при точно pH, соответствующем pKa. Для этих двух ионов пропорции не будут одинаковыми при использовании 0,8 единиц pH от их соответствующих pKas. концентрация ионов имеет вид +/- log ([BH] / [B-]), и зарядовая среда буфера не должна быть такой же. Я думаю, что более высокий pH для работы с MOPS будет иметь тенденцию к созданию более отрицательного заряда в растворе от MOPS, но также и от OH- в растворе, замедляя подвижность мицелл и способствуя разрешению более крупных белков с помощью MOPS.

Все это дается, даже если концентрация буферных ионов одинакова.

Я уверен, что кровавые подробности похоронены в затхлых фолиантах некоторых журналов по физической биохимии глубоко в библиотеке, но для меня это звучит так.


Книжная полка

Книжная полка NCBI. Служба Национальной медицинской библиотеки, Национальные институты здравоохранения.

Лодиш Х., Берк А., Зипурский С.Л. и др. Молекулярная клеточная биология. 4-е издание. Нью-Йорк: В. Х. Фриман, 2000.

  • По соглашению с издателем эта книга доступна для функции поиска, но не может быть просмотрена.


Как сделать скорость миграции белка пропорциональной молекулярной массе

Движение любого заряженного вещества через электрическое поле определяется его суммарным зарядом, его молекулярным радиусом и величиной приложенного поля. Но проблема с нативно свернутыми белками состоит в том, что ни их суммарный заряд, ни их молекулярный радиус не зависят от молекулярной массы. Вместо этого их чистый заряд определяется аминокислотным составом, то есть суммой положительных и отрицательных аминокислот в белке и молекулярным радиусом третичной структурой белка.

Таким образом, в своем естественном состоянии разные белки с одинаковой молекулярной массой будут перемещаться с разной скоростью в электрическом поле в зависимости от их заряда и трехмерной формы.

Чтобы разделить белки в электрическом поле только на основе их молекулярной массы, нам нужно разрушить третичную структуру, уменьшив белок до линейной молекулы, и каким-то образом замаскировать собственный чистый заряд белка. Вот где появляется SDS.


Вступление

В экспансионной микроскопии (ExM) консервированные биологические образцы заключаются в набухающий гидрогель и физически расширяются изотропно, что приводит к получению оптически прозрачных образцов, которые обеспечивают наноразмерное разрешение и микроскопию без аберраций на обычных микроскопах с дифракционным ограничением (Chen, Tillberg, & Boyden , 2015). Недавно были разработаны две новые версии ExM, получившие название микроскопии увеличения удержания белка (proExM Tillberg et al., 2016) и экспансионной флуоресценции. на месте гибридизация (ExFISH Chen et al., 2016), где молекулы белка (proExM) и РНК (ExFISH) химически прикрепляются к гидрогелю и исследуются при расширении. В этом модуле описаны наиболее распространенные сценарии подготовки проб proExM и ExFISH, а также общие рекомендации по работе с пробами и получению изображений.

В proExM белки ковалентно прикреплены к матрице гидрогеля с помощью коммерчески доступной небольшой молекулы (Acryloyl-X SE, или AcX для краткости Tillberg et al., 2016), которая связывается с первичными аминогруппами белков (рис. 1E, слева) и затем включается в полимер гидрогеля в процессе полимеризации (также известного как гелеобразование гидрогеля, схематически изображенного на фиг. 1A-1C). Ферментативное расщепление с использованием протеиназы K (ProK) или высокотемпературная обработка детергентом механически разрушает залитый образец, обеспечивая изотропное расширение в воде. Можно закрепить нативные белки на геле с помощью AcX и применить флуоресцентные антитела после экспансии (окрашивание после экспансии, рис. 1С). В этой версии используется метод механической гомогенизации с использованием высокой температуры и моющего средства без протеазы. В качестве альтернативы можно применить AcX к фиксированным образцам, экспрессирующим флуоресцентные белки и / или уже помеченным флуоресцентными антителами, включив их непосредственно в гель (предварительное окрашивание, рис. 1A, или экспрессия флуоресцентного белка перед расширением, рис. 1B). Флуоресцентные белки и антитела достаточно устойчивы к протеолизу, поэтому в значительной степени выживают при применении ProK. Использование линзы с ограниченным дифракцией разрешением 300 нм, результирующее линейное расширение встроенных образцов ~ 4,5 × (~ 90 × объемное расширение) позволяет получать изображения образца с эффективным разрешением ~ 300 нм / 4,5 ~ 60-70 нм. .

В ExFISH РНК ковалентно прикреплены к матрице гидрогеля с помощью небольшой молекулы, которую мы называем LabelX (которую можно легко синтезировать путем реакции двух коммерчески доступных молекул), которая связывается с гуанином (в РНК и ДНК, рис. 1E, справа) а также к полимеру гидрогеля (Chen et al., 2016). Трубопровод ExFISH показан на рисунке 1D: образцы обрабатываются LabelX, образуется набухающий гидрогелевый полимер, наносится ProK, а затем образец промывается физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS). После этого зонды RNA-FISH наносят на образец в буфере для гибридизации, чтобы пометить представляющие интерес молекулы РНК. Затем образец расширяется и отображается в буфере с низким содержанием соли. Эта ненулевая концентрация соли, которая позволяет зондам РНК-FISH оставаться стабильно связанными, приводит к ~ 3-кратному линейному расширению (~ 27-кратному объемному расширению) или эффективному разрешению для линзы с ограничением дифракции 300 нм ~ 300 нм / 3∼100 нм.

Этот блок состоит из следующих разделов. В основных протоколах 1 и 2 мы описываем протоколы proExM для клеток и интактных тканей (толщиной менее 200 мкм до размножения), которые были иммуноокрашены перед размножением (предварительное размножение proExM) или флуоресцентные белки экспрессировались перед размножением, как показано на Рисунок 1А, Б. Эти два основных протокола написаны независимо, так что читатели могут начать с одного из двух с минимальными ссылками на другой. В следующем разделе, Базовый протокол 3, описываются шаги, которые помогают обрабатывать толстые ткани или срезы тканей (например, толщиной от 200 до 500 мкм или потенциально более толстые), которые были иммуноокрашены или имели флуоресцентные белки, экспрессируемые перед размножением (как показано на рис. . 1А, Б). Протокол поддержки 1 описывает протокол иммуноокрашивания после размножения (окрашивание после размножения proExM, как показано на фиг. 1С). Мы также кратко обсуждаем ключевые соображения при выборе антител и красителей для proExM в протоколе поддержки 2. В основных протоколах 4 и 5 мы описываем методологию ExFISH для культивируемых клеток и интактных тканей, соответственно. В последнем протоколе, Базовый протокол 6, мы описываем различные стратегии монтажа для подготовки расширенных образцов ExM для визуализации на инвертированных конфокальных микроскопах и световом микроскопе Zeiss Z.1. Этот раздел по визуализации применяется ко всем образцам, обработанным ExM, включая продукты протоколов proExM и ExFISH, описанных здесь.

Может быть полезно отметить, что для подготовки образцов и получения изображений с помощью proExM и ExFISH требуются только химические вещества и микроскопы, которые можно найти в типичной биологической лаборатории или учреждении для визуализации, за исключением фиксирующих реагентов и акрилата натрия, которые коммерчески доступны по умеренной цене. Почти все этапы протокола можно выполнять при комнатной температуре на столе для влажной лаборатории (если иное не указано в протоколе). Основное необходимое оборудование включает настольный вихревой миксер, шейкер, инкубатор 37 ° C (и инкубатор 60 ° C для ExFISH культивированных клеток), эксикатор, холодильник на 4 ° C и морозильник -20 ° C. Все материалы и расходные материалы, используемые в этом устройстве, имеются в продаже. Если не указано иное, в этой единице «вода» конкретно означает «бидистиллированная вода».

1: proExM для культивированных клеток

Материалы

  • 1 М гидроксид калия (КОН) в воде
  • 30% (об. / Об.) Этанола в воде
  • 10 мг / мл стерильного фибронектина в фосфатно-солевом буфере (PBS Current Protocols, 2001)
  • Представляющие интерес клетки, например клетки эмбриональной почки человека (HEK)
  • Среда для культивирования клеток, подходящая для выбранного типа клеток (например, среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM) для клеток эмбриональной почки человека (HEK))
  • 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA) в PBS или, для более сильной фиксации, смесь 4% (мас. / Об.) PFA и 0,1% (мас. / Об.) Глутарового альдегида в PBS
  • 100 мМ глицин в PBS
  • 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 в PBS
  • Блокирующий буфер: 5% (об. / Об.) Нормальной ослиной сыворотки в 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 в PBS (хранить до 1 месяца или дольше при 4 ° C), сыворотка должна быть от животного-хозяина вторичные антитела, поэтому следует использовать другие типы сывороток вместо нормальной ослиной сыворотки, если вторичные антитела получены от других животных
  • Первичные и вторичные антитела для иммуноокрашивания
  • Базовый раствор AcX / DMSO (см. Рецепт)
  • Желирующий раствор для proExM культивируемых клеток (см. Рецепт)
  • Буфер для пищеварения (см. Рецепт)
  • Субстраты для клеточных культур (например, покровные стекла с размерами, формой и модификациями поверхности, подходящими для выбранного протокола культивирования), такие как круглые 12-миллиметровые покровные стекла или покровное стекло съемной камеры, например, Sigma, cat. нет. ГБЛ 112358
  • Инструмент для снятия защитного стекла камеры (Sigma, каталожный номер GBL 103259)
  • Чашки Петри 35 мм
  • Пробирки для микроцентрифуги
  • Шейкер
  • Покрытие 22 × 22 мм № 1,5 (толщина от 0,15 до 0,19 мм)
  • Покрытие 22 × 22 мм № 2 (толщина от 0,19 до 0,23 мм)
  • Предметные стекла для микроскопа
  • Ледяная баня или холодный блок, охлажденный до 4 ° C
  • Парафильм
  • Лезвие бритвы
  • Щипцы
  • 4-луночный прямоугольный планшет Nunc (Thermo Fisher, каталожный номер 267061)
  • Кисть
  • Алмазный писец для резки (разметки) тонкого стекла
  • Диссекционный микроскоп

Культура клеток

Клетки можно культивировать в соответствии с выбранными вами протоколами. Однако, если нет сильных предпочтений, мы рекомендовали культивировать клетки на субстрате, отделяемом от лунки для культивирования (например, на покровных стеклах) или на покровном стекле съемной камеры (например, Sigma, каталожный номер GBL 112358) для легкого гелеобразования. и обработка образцов на более поздних этапах.

В протоколе культивирования клеток, описанном ниже, используются линии прикрепленных клеток (например, HEK или COS7), и он продемонстрировал стабильные результаты. Если для культивирования клеток используются покровные стекла съемной камеры, начните с модификации поверхности стекла фибронектином на шаге 2.

1. Обработайте круглые покровные стекла диаметром 12 мм 1 М КОН в воде в течение 30 минут, промойте водой три раза и храните в 30% (об. / Об.) Этаноле в воде.

2. Высушите на воздухе очищенные 12-миллиметровые круглые покровные стекла в стерильной среде (например, в шкафу биобезопасности), поместите в 35-миллиметровую чашку Петри и затем обработайте 10 мг / мл стерильного фибронектина в PBS в течение 30 минут при 37 °. С. Удалите раствор фибронектина непосредственно перед посевом клеток.

3. Клетки высевают и культивируют на поверхности 12-миллиметровых покровных стекол или покровного стекла съемной камеры до конфлюэнтности от 50% до 80% в увлажненном инкубаторе, установленном на 5% CO.2 и 37 ° С.

Фиксация клеток

Ячейки могут быть исправлены с использованием протоколов по вашему выбору. Например, можно использовать 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA) в PBS. Для более прочной фиксации, которая сохраняет большую ультраструктуру, вы можете попробовать использовать смесь PFA и небольшого процента глутаральдегида (например, 4% (мас. / Об.) PFA плюс 0,1% (мас. / Об.) Глутаральдегида в PBS), хотя До настоящего времени фиксаторы редко использовались в исследованиях с помощью экспансионной микроскопии. 4% (мас. / Об.) PFA в PBS обычно готовят свежеприготовленным перед фиксацией.

Протокол фиксации, описанный ниже, продемонстрировал стабильные результаты. Обратите внимание, что все этапы промывки следует выполнять быстро, чтобы избежать обезвоживания образца.

4. Замените среду для культивирования клеток 4% (мас. / Об.) PFA в PBS и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.

ВНИМАНИЕ: Это следует делать в химическом шкафу, так как PFA считается потенциальным канцерогеном.

5. Удалите раствор PFA и промойте клетки в течение 5 минут 100 мМ глицином в PBS, чтобы погасить фиксацию.

6. Удалите раствор глицина и дважды промойте клетки PBS по 5 мин.

7. Мы рекомендуем немедленно перейти к следующим шагам протокола.

При необходимости фиксированные клетки можно хранить в темноте при 4 ° C в PBS до нескольких недель до следующих шагов протокола.

Иммуноокрашивание / иммуногистохимия (по желанию)

Для иммуноокрашивания после фиксации следуйте протоколам по вашему выбору, вы можете выполнить обычную гистологию. Протокол, описанный ниже, продемонстрировал согласованные результаты с фиксированными клетками, приготовленными по протоколам, описанным ранее.

8. Сделайте фиксированные клетки проницаемыми, нанося 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 в PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. Чтобы уменьшить неспецифическое связывание антител, примените блокирующий буфер при комнатной температуре в течение 15 мин.

9. Инкубируйте клетки с первичными антителами в блокирующем буфере при соответствующей концентрации. Инкубацию можно проводить на шейкере на низкой скорости в течение периода от 1 часа до ночи, при комнатной температуре или при 4 ° C, в зависимости от характеристик антител.

10. Удалите раствор антител и промойте четыре раза по 5 мин блокирующим буфером.

11. Инкубируйте клетки со вторичными антителами в блокирующем буфере на шейкере на низкой скорости в течение 2–4 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C. При использовании антител, конъюгированных с красителями, см. Протокол поддержки 2 для обсуждения совместимости красителя с предварительным расширением окрашивания proExM.

12. Удалите раствор антител и промойте четыре раза по 5 мин блокирующим буфером.

13. Мы рекомендуем немедленно перейти к следующим шагам протокола.

При необходимости образцы можно хранить в темноте при 4 ° C в PBS до нескольких недель до следующих шагов протокола.

Гелеобразование

14. Приготовьте основной раствор акрилоил-X SE (AcX) / ДМСО, раствор мономера (исходный раствор X) TEMED и исходный раствор персульфата аммония (APS), как указано в разделе «Реагенты и растворы».

15. Замените буфер для образца (например, блокирующий буфер, если иммуноокрашен в соответствии с описанными выше протоколами) 0,1 мг / мл Acryloyl-X SE (AcX) в PBS.

Этот раствор AcX получают разбавлением 10 мг / мл исходного раствора AcX / DMSO 1: 100 в PBS.

16. Оставьте клетки в растворе AcX с концентрацией 0,1 мг / мл на 2–3 часа при комнатной температуре.

Предыдущие протоколы предлагали & gt6 часов или на ночь, но мы обычно считаем, что 2–3 часа более чем достаточно времени без встряхивания.

17. Когда клетки культивируют в чашке Петри, камеру для гелеобразования можно сконструировать тем временем, поместив на предметное стекло две прокладки, разделенные друг от друга на достаточно большое расстояние, чтобы покровное стекло образца могло поместиться между ними (Рис. . 2А). Тонкие и плоские предметы, например стопки покровных стекол, могут служить разделителями. Например, стопка из двух покровных стекол № 1.5 имеет высоту примерно от 0,30 до 0,38 мм путем изменения количества или типов покровных стекол, высота разделителей может быть отрегулирована соответствующим образом, чтобы соответствовать субстрату культуры клеток (т. Е. Образец покровное стекло) высота. Высота спейсера должна быть близка к высоте субстрата клеточной культуры, чтобы не оставлять лишний гель на поверхности образца, но общая толщина геля [т.е. (высота спейсера) - (высота субстрата клеточной культуры)] должна быть не менее 0,15 мм для облегчения работы с гелем на более поздних этапах. На прокладки можно нанести каплю воды (например, несколько мкл), чтобы прикрепить их к слайду (и, если прокладок несколько, друг к другу). Если на этапах 2–3 для культивирования клеток используется покровное стекло со съемной камерой, само покровное стекло и прокладка могут служить камерой для гелеобразования и прокладкой, соответственно. В этом случае верхняя часть защитного стекла съемной камеры может быть снята с помощью съемника (Sigma, каталожный номер GBL 103259). Для крышки камеры гелеобразования можно использовать толстое и прочное покровное стекло (например, покровное стекло № 2), обернутое парафильмом, причем парафильм предотвращает прилипание геля к покровному стеклу при снятии крышки на более поздних этапах. Убедитесь, что поверхность Parafilm ровная, чистая и не имеет складок. Мы рекомендуем завершить подготовку камеры гелеобразования и крышки перед тем, как перейти к следующему этапу.

18. После инкубации клеток в растворе AcX промойте клетки дважды, каждый раз по 15 мин, PBS. Начните размораживание компонентов гелеобразующего раствора для proExM - исходных растворов Stock X, APS и TEMED. Храните растворы охлажденными на ледяной бане или на холодном блоке (охлажденном до 4 ° C).

19. Создайте гелеобразующий раствор для proExM сейчас, смешав исходный раствор X, воду, исходный раствор ТЕМЕД и исходный раствор APS в соотношении 47: 1: 1: 1 (гелеобразующий раствор также см. Рецепты в разделе «Реагенты и растворы») в этом порядке ( т.е. последний APS) в пробирке для микроцентрифуги и перемешайте на вортексе в течение нескольких секунд.

Количество гелеобразующего раствора следует увеличивать или уменьшать в зависимости от размера камеры гелеобразования. Например, 200 мкл гелеобразующего раствора достаточно, чтобы заполнить камеру гелеобразования пустотой 22 × 22 × 0,38 мм. Смешанный гелеобразующий раствор следует хранить на ледяной бане или на холодном блоке (охлажденным до 4 ° C). Избегайте чрезмерного нагревания гелеобразующего раствора, например, держась за крышку микроцентрифужной пробирки, а не за корпус пробирки. После приготовления гелеобразующего раствора мы рекомендуем выполнить следующие несколько шагов (до помещения камеры гелеобразования в инкубатор при 37 ° C на этапе 24) в течение 5 минут, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.

20. Сразу после предыдущего шага удалите PBS из клеток с помощью пипетки и добавьте небольшое количество смешанного гелеобразующего раствора к клеткам на субстрате для клеточной культуры. Если используется покровное стекло съемной камеры, удалите PBS и добавьте гелеобразующий раствор, чтобы заполнить камеру, затем перейдите к шагу 22.

21. С помощью пинцета возьмите и поместите субстрат для культивирования клеток (т.е. покровное стекло, на котором культивируются клетки) с культивируемыми клетками между спейсерами в камере гелеобразования. Убедитесь, что ячейки обращены вверх. Слегка надавите на субстрат клеточной культуры, чтобы удержать его на месте. Если гелеобразующий раствор вытечет, повторно нанесите небольшое количество гелеобразующего раствора на клетки.

22.Добавьте каплю (~ 20 мкл) гелеобразующего раствора на одну сторону крышки, покрытой парафильмом, и переверните ее так, чтобы капля свисала с поверхности из-за поверхностного натяжения (рис. 2А). Медленно опустите крышку, чтобы капля слилась с гелеобразующим раствором на покровном стекле образца (рис. 2B). После плавления продолжайте опускать крышку, чтобы она опиралась на распорки. Убедитесь, что во время этого процесса внутри раствора нет воздушных карманов.

23. Используя пипетку с тонким наконечником, продолжайте добавлять дополнительный гелеобразующий раствор к обеим открытым сторонам камеры, пока пространство между крышкой, прокладками и предметным стеклом не заполнится гелеобразующим раствором (рис. 2С).

Капиллярные силы должны заставлять гелеобразующий раствор равномерно заполнять пустоты.

24. Поместите камеру гелеобразования в инкубатор при 37 ° C на 1 час для полимеризации. Будьте осторожны, не наклоняйте и не трясите камеру во время переноса и гелеобразования.

Пищеварение

25. Выньте камеру гелеобразования из инкубатора.

26. Медленно вставьте лезвие бритвы сбоку между крышкой и распорками и подденьте крышку. Как только крышка отделена от геля, используйте лезвие бритвы, чтобы удалить прокладки (рис. 2D). Если используется покровное стекло съемной камеры, снимите крышку, затем с помощью щипцов снимите черную прокладку, не удаляя гель с покровного стекла.

27. Используя лезвие бритвы, обрежьте гель вокруг образца до небольшого объема. Это сохранит компактность геля и поможет найти клетки на более поздних этапах. Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить субстрат клеточной культуры и гель вместе со стеклянного предметного стекла. Если используется покровное стекло съемной камеры, обрежьте гель, но не удаляйте гель с покровного стекла.

Вы можете обрезать гель, чтобы он имел асимметричную форму, чтобы его ориентацию можно было легко определить на более поздних этапах, просто изучив форму [см. Наше видео на https://www.youtube.com/watch?v=OksNCAJwxVI ( proExM для тканей: демонстрация гелеобразования)].

28. Подготовьте буфер для разложения, как описано в разделе «Реагенты и растворы» (конечная концентрация ProK: 8 Ед / мл).

29. Поскольку гель расширяется примерно в 1,5 раза во время разложения, выберите для разложения подходящий большой контейнер (например, чашку Петри). Кроме того, используйте отдельный контейнер для каждого образца, чтобы избежать смешивания образцов. Поместите субстрат для клеточной культуры с гелем в контейнер и заполните его буфером для переваривания, объем которого по крайней мере в 10 раз превышает объем геля (рис. 2E). Погрузите гель в буфер для разложения по крайней мере на 2–3 часа, пока он естественным образом не отделится от покровного стекла образца (рис. 2F). Если используется покровное стекло съемной камеры, используйте алмазную палочку, чтобы отделить каждый образец и соответствующий ему кусок покровного стекла, аккуратно разметав покровное стекло и отломив каждый кусок стекла с кусочком геля. Поместите каждый кусок покровного стекла с гелем в контейнер и погрузите в буфер для разложения, как описано выше. Например, 4-луночный прямоугольный планшет Nunc может содержать несколько кусков покровного стекла для пищеварения. Отделившийся клеточный субстрат можно удалить с помощью щипцов, чтобы в буфере для переваривания остался только гель, содержащий клетки.

30. Оставьте гель погруженным в буфер для разложения на ночь при комнатной температуре в темноте.

Хранение и расширение

31. Если это не было сделано ранее, осторожно удалите отслоившийся клеточный субстрат (например, покровное стекло) из контейнера для разложения с помощью щипцов, не нарушая геля образца. Удалите буфер для разложения и добавьте PBS, и храните гель при 4 ° C в темноте, если желательно хранение для более поздних визуализаций.

Будьте осторожны, чтобы не впитать гель во время дозирования. На этом этапе гель немного рассеивает свет, поэтому изменение угла падения света может помочь найти его внутри раствора.

32. Если гель необходимо перенести в другой контейнер (например, контейнер большего размера для обрезки или держатель образца для визуализации), вы можете использовать кисть подходящего размера, чтобы подобрать и переместить гель. Чтобы избежать обезвоживания геля, добавьте в контейнер немного PBS.

33. Перед расширением образца мы рекомендуем обрезать гель до минимально необходимого размера. Вы можете использовать диссекционный микроскоп или широкопольный микроскоп с малым увеличением, чтобы определить местонахождение интересующей области. Чтобы свести к минимуму перемещение образца, большую часть окружающей жидкости можно временно удалить во время обрезки. Под микроскопом используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать и удалить гель за пределами интересующей области. Мы советуем обрезать гель до асимметричной формы, чтобы легко определить ориентацию. Обязательно обрезайте гель до разумного размера для работы и визуализации, так как расширение приведет к дополнительному линейному увеличению в 2–2,5 раза (в общей сложности примерно 4,5 раза). Перенесите гель с интересующими областями в контейнер (например, чашку Петри подходящего размера для расширения или держатель образца для визуализации), который достаточно велик, чтобы содержать расширенный гель.

34. Наполните емкость, погрузите гель в воду и подождите 20 мин. Замените воду и подождите еще 20 мин. Повторите замену еще раз (20 мин в пресной воде, всего три раза).

Образец должен быть полностью расширен и оптически очищен, как показано на рисунке 3, и готов к визуализации (это время короче, чем в предыдущих публикациях, но отражает числа, которые подходят для повседневного использования в нашей лаборатории). Для долгосрочной визуализации, например, при визуализации большого объема образца, установка образца необходима после расширения и перед визуализацией (см. Базовый протокол 6). Крепление образца прикрепляет образец к держателю образца и, таким образом, предотвращает его смещение, а также помогает удерживать образец в пределах рабочего расстояния линзы объектива. Для быстрой проверки расширенного образца под микроскопом (<5 мин) установка образца обычно не требуется. Например, в инвертированном микроскопе вы можете использовать пипетку, чтобы временно (<5 мин) удалить воду вокруг геля, чтобы предотвратить ее соскальзывание.

35. Если вам нужно перенести расширенный гель в новый контейнер, с ним нужно обращаться осторожно, так как в расширенном состоянии он несколько хрупкий. Сначала удалите большую часть окружающей воды, а затем с помощью кисти нанесите гель на чистое покровное стекло, помещенное в тот же контейнер. Затем осторожно приподнимите покровное стекло (с гелем наверху) из контейнера с помощью щипцов. Гель можно перенести, медленно смахнув его с покровного стекла в новый контейнер. Этот метод также можно использовать для переворота геля, перевернув покровное стекло с гелем, если гель направлен в неправильном направлении.

2: proExM для интактных тканей

Базовый протокол для интактных тканей немного отличается от протокола для культивированных клеток. Из-за толщины образцов неповрежденным тканям требуется больше времени для диффузии AcX. Кроме того, в гелеобразующий раствор добавлен ингибитор полимеризации, чтобы обеспечить более длительную диффузию гелеобразующего раствора через образцы до начала полимеризации.

Материалы

  • Физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS Current Protocols, 2001)
  • 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA) в PBS или, для более сильной фиксации, смесь 4% (мас. / Об.) PFA и 0,1% (мас. / Об.) Глутарового альдегида в PBS
  • Тонущий раствор (см. Рецепт)
  • Сухой лед
  • 2-метилбутан
  • Оптимальная температура резки (OCT), M-1 или другая заливочная матрица
  • 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 в PBS
  • Блокирующий буфер: 5% (об. / Об.) Нормальная ослиная сыворотка в 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 в PBS (хранить до 1 месяца или дольше при 4 ° C): сыворотка должна быть от животного-хозяина вторичные антитела, поэтому следует использовать другие типы сывороток вместо нормальной ослиной сыворотки, если вторичные антитела получены от других животных.
  • Первичные и вторичные антитела для иммуноокрашивания
  • Базовый раствор AcX / DMSO (см. Рецепт)
  • Желирующий раствор для расширения интактных тканей (см. Рецепт)
  • Буфер для пищеварения (см. Рецепт)
  • Вибратом или криостат микротом
  • Покрытие 22 × 22 мм № 1,5 (толщина от 0,15 до 0,19 мм)
  • Покрытие 22 × 22 мм № 2 (толщина от 0,19 до 0,23 мм)
  • Предметные стекла для микроскопа
  • Парафильм
  • Пробирки для микроцентрифуги
  • Кисть
  • Ледяная баня или холодный блок, охлажденный до 4 ° C
  • Лезвие бритвы
  • Щипцы
  • чашки Петри
  • Диссекционный микроскоп

Подготовка ткани

В этом базовом протоколе ткани proExM предполагается, что толщина ткани или среза ткани составляет менее 200 мкм в самом тонком измерении. Для образцов тканей толщиной более 200 мкм см. Основной протокол 3.

Ткани можно зафиксировать с помощью протоколов по вашему выбору. Например, можно использовать иммерсионную или перфузионную фиксацию с 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом (PFA) в PBS. Для более прочной фиксации, которая сохраняет большую ультраструктуру, вы можете попробовать смесь PFA и небольшого процента глутаральдегида (например, 4% (мас. / Об.) PFA плюс 0,1% (мас. / Об.) Глутаральдегида в PBS), хотя фиксаторы, содержащие глутаральдегид до настоящего времени в протоколах экспансионной микроскопии использовались реже. 4% (мас. / Об.) PFA в растворе PBS обычно готовят свежеприготовленным перед фиксацией.

1. После фиксации, если ткани толще 200 мкм, разрежьте их на срезы размером менее 200 мкм с помощью вибратома. В качестве альтернативы, для разрезания в криостате ткань необходимо сначала защитить криозащищенным способом, погрузив ее в тонущий раствор до тех пор, пока ткань не опустится на дно. Затем ткань вынимают и замораживают, используя сухой лед и 2-метилбутан. После встраивания его в ОКТ, М-1 или другую матрицу встраивания образец готов к нарезке с помощью криотома.

После любого метода нарезки мы рекомендуем немедленно перейти к следующим шагам протокола.

При необходимости фиксированные ткани или срезы тканей можно хранить в темноте при 4 ° C в PBS до нескольких недель до следующих шагов протокола.

Иммуноокрашивание / иммуногистохимия (по желанию)

Для иммуноокрашивания после фиксации следуйте выбранным протоколам. Протокол, описанный ниже, продемонстрировал согласованные результаты с фиксированными тканями мозга, подготовленными по протоколам, описанным ранее.

2. Увеличьте проницаемость фиксированной ткани, нанеся 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 в PBS при комнатной температуре на 15 минут, затем в блокирующем буфере при комнатной температуре на 6 часов.

3. Инкубируйте ткани с первичными антителами в блокирующем буфере. Инкубацию можно проводить на шейкере на низкой скорости в течение ночи при комнатной температуре или при 4 ° C.

4. Удалите раствор антител и промойте четыре раза, каждый раз по 30 мин блокирующим буфером, чтобы удалить несвязанные первичные антитела.

5. Инкубируйте ткани с вторичными антителами в блокирующем буфере на шейкере на низкой скорости в течение ночи при комнатной температуре или при 4 ° C. При использовании антител, конъюгированных с красителями, см. Протокол поддержки 2 для описания характеристик красителя и совместимости с предварительным расширением окрашивания proExM.

6. Удалите раствор антител и промойте четыре раза, каждый раз по 30 мин, блокирующим буфером для удаления несвязавшихся вторичных антител.

7. Мы рекомендуем немедленно переходить к этапам гелеобразования.

При необходимости образцы можно хранить в темноте при 4 ° C в PBS до нескольких недель до образования геля.

Гелеобразование

8. Приготовьте основной раствор акрилоил-X SE (AcX) / ДМСО, раствор мономера (исходный X), исходный раствор TEMED, исходный раствор персульфата аммония (APS) и раствор 4-гидрокси-TEMPO (4HT), как указано в разделе «Реагенты и растворы».

9. Замените буфер для образца (например, блокирующий буфер, если иммуноокрашен в соответствии с описанными выше протоколами) 0,1 мг / мл Acryloyl-X SE (AcX) в PBS.

Раствор AcX получают разбавлением 10 мг / мл исходного раствора AcX / DMSO 1: 100 в PBS.

10. Оставьте ткани в растворе AcX на & gt6 часов (можно оставить на ночь) при комнатной температуре без встряхивания.

11. Между тем, чтобы построить камеру гелеобразования, поместите две прокладки на предметное стекло, отделенные друг от друга (рис. 4A). Тонкие и плоские предметы, например стопки покровных стекол, могут служить разделителями. Например, стопка из двух покровных стекол № 1.5 имеет высоту от 0,30 до 0,38 мм, и, изменяя количество или типы покровных стекол, высоту разделителей можно регулировать в соответствии с толщиной ткани. Высота спейсера должна быть близка к толщине ткани, чтобы не оставлять чрезмерное количество геля на поверхности образца, но общая толщина геля (то есть высота спейсера) должна быть не менее 0,15 мм для облегчения работы с гелем на более поздних этапах. Каплю воды (например, несколько мкл) можно нанести на прокладки, чтобы прикрепить их к предметному стеклу (и, если прокладок несколько, друг к другу). Для крышки камеры гелеобразования можно использовать толстое и прочное покровное стекло (например, покровное стекло № 2), обернутое парафильмом, причем парафильм предотвращает прилипание геля к покровному стеклу при снятии крышки на более поздних этапах. Убедитесь, что поверхность Parafilm ровная, чистая и не имеет складок. Мы рекомендуем закончить подготовку камеры гелеобразования и крышки, прежде чем переходить к следующему этапу.

12. После инкубации тканей в растворе AcX дважды промойте ткани PBS, каждый раз по 15 мин. Начните размораживание компонентов гелеобразующего раствора для исходных растворов proExM: Stock X, 4HT, APS и TEMED. Храните растворы охлажденными на ледяной бане или на холодном блоке (охлажденном до 4 ° C).

13. Добавьте Stock X, 4HT, TEMED и APS в соотношении 47: 1: 1: 1 в этом порядке (т.е. APS последний) в пробирку для микроцентрифуги (гелеобразующий раствор также см. Рецепт в разделе «Реагенты и растворы») и встряхните для перемешивания. несколько секунд. Количество гелеобразующего раствора должно увеличиваться или уменьшаться в соответствии с размером камеры гелеобразования и размером ткани или среза ткани и должно быть по крайней мере в 100 раз больше по объему. Например, по крайней мере 400 мкл гелеобразующего раствора используется для инкубации 100-мкм одиночного коронкового среза мозга мыши, чего достаточно для заполнения камеры гелеобразования с пустотой 22 × 22 × 0,38 мм, которая может соответствовать полному коронковому срезу мозга мыши. . Чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию гелеобразующего раствора, APS следует добавлять в раствор в последнюю очередь перед встряхиванием. Кроме того, смешанный гелеобразующий раствор следует хранить на ледяной бане или на холодном блоке (охлажденном до 4 ° C). Избегайте чрезмерного нагревания гелеобразующего раствора, например, удерживая крышку микроцентрифужной пробирки, а не тело пробирки. Наконец, мы рекомендуем выполнить следующие шаги (до помещения микроцентрифужной пробирки с гелеобразующим раствором и образцом при 4 ° C на этапе 15) в течение 5 минут, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.

14. Сразу после предыдущего шага используйте мягкую кисть для переноса и погружения тканей в желирующий раствор в микроцентрифужной пробирке.

15. Держите микроцентрифужную пробирку с образцом и гелеобразующим раствором при 4 ° C в темноте в течение 30 минут. После 30-минутной инкубации мы рекомендуем выполнить следующие несколько шагов (до помещения камеры гелеобразования в инкубатор 37 ° C на этапе 19) в течение 5 минут, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.

16. С помощью кисти перенесите и поместите кусочек ткани между прокладками в камере гелеобразования. Убедитесь, что ломтик лежит ровно, без складок и деформаций. Мы рекомендуем сначала добавить каплю 20 мкл гелеобразующего раствора между разделителями, перенести кусочек ткани в каплю и с помощью кисти медленно разровнять ткань в жидкой среде, осторожно прижимая ее к стеклянной поверхности.

17. Добавьте каплю 20 мкл гелеобразующего раствора на одну сторону крышки и переверните ее так, чтобы капля свисала с поверхности из-за поверхностного натяжения (рис. 4A). Медленно опустите крышку, чтобы капля слилась с гелеобразующим раствором на покровном стекле образца (рис. 4B). После плавления продолжайте опускать крышку, чтобы она опиралась на распорки. Убедитесь, что во время этого процесса внутри раствора нет воздушных карманов.

18. Используя дозатор и тонкий наконечник для дозатора, продолжайте добавлять дополнительный гелеобразующий раствор к обеим открытым сторонам камеры, пока пространство между крышкой, прокладками и предметным стеклом не заполнится (рис. 4C).

Капиллярные силы заставят гелеобразующий раствор равномерно заполнить камеру.

19. Поместите камеру гелеобразования в инкубатор при 37 ° C на 2 часа для полимеризации. Будьте осторожны, не наклоняйте и не трясите камеру во время переноса и гелеобразования.

Пищеварение

20. Выньте камеру гелеобразования из инкубатора.

21. Медленно вставьте лезвие бритвы сбоку между крышкой и распорками и подденьте крышку. Как только крышка отделена от геля, продолжайте использовать лезвие бритвы, чтобы удалить прокладки аналогичным образом (рис. 4D).

22. Используя лезвие бритвы, срежьте излишки геля.

Обрезка геля сохранит его компактность и поможет найти интересующие области на более поздних этапах. Вы можете обрезать гель, чтобы он имел асимметричную форму, чтобы его ориентацию можно было легко определить на более поздних этапах, просто изучив форму [см. Наше видео на https://www.youtube.com/watch?v=OksNCAJwxVI ( proExM для тканей: демонстрация гелеобразования)].

23. Подготовьте буфер для разложения, как описано в разделе «Реагенты и растворы» (конечная концентрация ProK составляет 8 Ед / мл).

Мы рекомендуем приготовить достаточное количество буфера для переваривания, чтобы его объем был как минимум в 10 раз больше, чем у геля.

24. Используйте кисть, чтобы смочить гель и его стороны буфером для разложения. Подождите от 10 до 30 секунд, пока буфер для переваривания не пропитает границу геля.

Это поможет получить доступ к дну геля с помощью кисти, чтобы гель можно было легче отделить от стеклянной подложки.

25. Снимите гель, осторожно исследуя пространство между гелем и стеклянной поверхностью тонкой кистью. Так как гель расширяется примерно в 1,5 раза во время переваривания, выберите для стадии переваривания контейнер подходящего размера, например чашку Петри. Для небольших образцов ткани и срезов ткани в качестве контейнера можно использовать микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Для каждого образца используйте отдельные контейнеры, заполненные буфером для разложения. Оставьте гели погруженными в буфер для разложения на & gt8 часов (хорошо на ночь) при комнатной температуре в темноте (рис. 4E, F).

Хранение и расширение

26. Удалите буфер для разложения и добавьте PBS, и храните гель при 4 ° C в темноте, если требуется хранение для более поздних визуализаций. Будьте осторожны, чтобы не впитать гель во время дозирования.

На этом этапе внедренная ткань слегка рассеивается, поэтому изменение угла падения света может помочь найти ее внутри раствора.

27. Если гель необходимо перенести в другой контейнер (например, контейнер большего размера для обрезки или держатель образца для визуализации), вы можете использовать кисть подходящего размера, чтобы подобрать и переместить гель. Чтобы избежать обезвоживания образца, добавьте в новый контейнер немного PBS.

28. Перед расширением образца мы рекомендуем обрезать гель до минимально необходимого размера. Вы можете использовать диссекционный микроскоп или широкопольный микроскоп с малым увеличением, чтобы определить местонахождение интересующей области. Чтобы свести к минимуму перемещение образца, большую часть окружающей жидкости можно временно удалить во время обрезки. Под микроскопом используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать и удалить гель за пределами интересующей области. Мы советуем обрезать гель до асимметричной формы, чтобы легко определить ориентацию.Обязательно обрезайте гель до разумного размера для работы и визуализации, так как расширение приведет к дополнительному линейному увеличению размера от 2 × до 2,5 × (в общей сложности примерно 4,5 ×). Перенесите гель с интересующими областями в контейнер (например, чашку Петри подходящего размера для расширения или держатель образца для визуализации), который достаточно велик, чтобы содержать расширенный гель.

29. Наполните емкость, погрузите гель в воду и подождите 20 мин. Замените воду пресной и подождите еще 20 мин. Повторите замену еще раз (20 минут в пресной воде, всего три смены). Образец должен быть полностью расширен и оптически очищен (см. Рис. 3 для расширенного полусреза мозга мыши) и готов к визуализации (это время короче, чем в предыдущих публикациях, но отражает числа, которые подходят для повседневного использования в нашей лаборатории). Пример изображений до и после расширения среза мозга, содержащего нейроны, экспрессирующие Brainbow 3.0, показан на рисунке 5. Для долгосрочной визуализации, например, при визуализации большого объема образца, установка образца необходима после расширения. и перед визуализацией (см. Основной протокол 6). Крепление образца прикрепляет образец к держателю образца и, таким образом, предотвращает его смещение, а также помогает удерживать образец в пределах рабочего расстояния линзы объектива. Для быстрой проверки расширенного образца под микроскопом (<5 мин) установка образца обычно не требуется. Например, в инвертированном микроскопе вы можете использовать пипетку, чтобы временно (<5 мин) удалить воду вокруг геля, чтобы предотвратить ее соскальзывание.

30. Если вам нужно перенести расширенный гель в новый контейнер, с ним нужно обращаться осторожно, так как в расширенном состоянии он несколько хрупкий. Сначала удалите большую часть окружающей воды, а затем с помощью кисти нанесите гель на чистое покровное стекло, помещенное в тот же контейнер. Затем осторожно приподнимите покровное стекло (с гелем наверху) из контейнера с помощью щипцов. Гель можно перенести, медленно смахнув его с покровного стекла в новый контейнер. Этот метод также можно использовать для переворота геля, перевернув покровное стекло с гелем, если гель направлен в неправильном направлении.

3: proExM для образцов толстых неповрежденных тканей (от 200 до 500 мкм)

Для тканей и срезов тканей толщиной от 200 до 500 мкм необходимо изменить основной протокол тканей (Основной протокол 2), чтобы обеспечить более глубокое проникновение реагентов. Кроме того, необходимо увеличить время переваривания. Мы успешно использовали этот протокол для увеличения толщины образцов до 500 мкм, также возможно расширение образцов толщиной более 500 мкм.

Дополнительные материалы (также см. Базовый протокол 2)

  • 2-(N-морфолино) этансульфоновая кислота (MES) - забуференный физиологический раствор (MBS): 100 мМ MES / 150 мМ NaCl в воде, pH доведен до 6

1. Создание образца ткани описано в шагах 1–7 Базового протокола 2 и может использоваться для более толстых образцов ткани.

2. Для этапа AcX (основной протокол 2, этап 9) следует использовать слегка кислый буфер, чтобы подавить реактивность эфира NHS молекулы AcX, чтобы обеспечить более глубокое проникновение в ткань. Обычно мы используем физиологический раствор с MES-буфером (MBS) для этого слегка кислого буфера. Разбавьте основной раствор AcX / DMSO 10 мг / мл в МБС в соотношении 1: 100. Оставьте ткань в растворе AcX в МБС на срок до 24 часов при комнатной температуре, в зависимости от толщины образца. Обычно мы уделяем больше времени более толстым тканям. Например, мы оставляем срез мозга 500 мкм в растворе AcX / MBS на 24 часа.

3. Для приготовления гелеобразующего раствора (основной протокол 2, шаг 13) увеличьте количество 4HT на 50% (т.е. соотношение между исходным X и 4HT 47: 1,5) для более длительного ингибирования полимеризации во время инкубации. Для инкубации (основной протокол 2, шаг 15) погрузите образец в гелеобразующий раствор на 45-60 минут (вместо 30 минут) при 4 ° C, прежде чем переносить его в камеру гелеобразования.

4. Для пищеварения (основной протокол 2, шаг 25) необходимо более длительное и сильное пищеварение. Расщепление ProK может проводиться в течение более длительного времени и / или при более высокой температуре (от 50 ° до 60 ° C), в зависимости от биологического состава ткани и того, насколько сильно она перекрестно связана после фиксации. Например, для среза мозга мыши толщиной 250 мкм двухдневное переваривание при комнатной температуре дало адекватное переваривание образца. В этом случае гелеобразный срез мозга переваривали в буфере для переваривания (с ProK) при комнатной температуре в течение 1 дня, затем старый буфер заменяли на свежий буфер для переваривания (с ProK) и переваривали в течение еще одного дня.

1: Иммуноокрашивание после расширения для proExM

Иммуноокрашивание можно проводить после расширения, как показано на рисунке 1C. Можно выполнить стадию механической гомогенизации с использованием ProK, а затем добавить антитела. Однако только некоторые эпитопы, такие как YFP, могут выжить после обработки ProK и могут быть окрашены после экспансии, большинство эпитопов этого не делают.

Чтобы сохранить большинство эпитопов, можно использовать более мягкий метод, такой как денатурация белка путем автоклавирования в буфере, обогащенном щелочным детергентом (или, в качестве альтернативы, обработка мягкой протеазой, которая разрезает только небольшое количество сайтов в белках, например LysC). используется для механической гомогенизации (рис. 1C, также см. дополнительный рисунок 1 Tillberg et al., 2016). Ниже мы описываем протокол нарушения работы автоклава. Примеры использования различных антител см. На дополнительном рисунке 1 у Tillberg et al., 2016.

Следующий протокол относится к базовому протоколу 2, и в него включен пример с использованием срезов мозга мыши Thy1-YFP и окрашивания анти-GFP после экспансии (рис. 6).

Дополнительные материалы (также см. Базовый протокол 2)

1. Залить срез мозга мыши AcX и вставить в гидрогель, как описано в основном протоколе 2.

После гелеобразования образец можно отделить от стеклянной подложки и временно хранить в 1М растворе NaCl (например, в течение нескольких минут или часов) перед следующим этапом.

2. Замочите образец в щелочном буфере на 15 мин, затем замените раствор свежим щелочным буфером того же состава. Поместите образец, погруженный в буфер, в автоклавируемый контейнер (например, полипропиленовый флакон), оставив крышку приоткрытой для сброса давления. Автоклавировать образцы в щелочном буфере в режиме жидкостной стерилизации при температуре 121 ° C в течение 1 часа. Во время этого и последующих шагов образец заметно расширится.

3. Дайте образцу остыть до комнатной температуры и дважды промойте, каждый раз по 15 мин, PBS.

4. Инкубируйте образец с первичными антителами в 0,1% (мас. / Об.) Triton X-100 плюс 5% (об. / Об.) Нормальной ослиной сыворотке в PBS (блокирующем буфере) на шейкере на низкой скорости в течение ночи при комнатной температуре или 4 °. С.

Сыворотка в блокирующем буфере должна быть от животного-хозяина вторичных антител, поэтому следует использовать другие типы сывороток вместо нормальной ослиной сыворотки, если вторичные антитела получены от других животных.

5. Удалите раствор первичных антител и промойте четыре раза, каждый раз по 30 мин, блокирующим буфером.

6. Инкубируйте образец с выбранным флуоресцентно меченным вторичным антителом в блокирующем буфере на шейкере на низкой скорости в течение ночи при комнатной температуре или 4 ° C.

7. Удалите раствор вторичных антител и промойте четыре раза, каждый раз по 30 мин, блокирующим буфером.

8. При желании замените буфер на PBS для хранения (до нескольких недель). Расширьте до конечного коэффициента ~ 4,5 × с тремя 20-минутными промывками в воде, а затем приступите к визуализации (см. Основной протокол 6).

Для получения более подробной информации о том, как выполнять определенные шаги, указанные выше, например, относительно обработки образцов, обратитесь к соответствующим шагам в Базовом протоколе 2.

2: Флуоресцентные белки, антитела и красители для проэксма

Для варианта proExM, показанного на рисунке 1C (пост-экспансионное окрашивание proExM), любой краситель, конъюгированный со вторичным антителом, должен быть совместим с протоколом, поскольку краситель вводится только в конце процесса.

Для вариантов proExM, показанных на рис. 1A, B (предварительное окрашивание proExM), большинство флуоресцентных белков совместимы с ранее описанными базовыми протоколами proExM (см. Рис. 1b у Tillberg et al., 2016). Например, флуоресцентные белки с β-стволом (например, GFP-подобные) устойчивы к протеазам и могут достаточно хорошо выдерживать переваривание ProK (например, удерживание флуоресценции> 50% для многих флуоресцентных белков), но флуоресцентные белки, не относящиеся к β-стволу (например, инфракрасные флуоресцентные белки на основе бактериофитохромов) деградируют на стадии ProK. Для антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями, большинство красителей совместимы с основными протоколами proExM (например, удержание флуоресценции> 40%), за исключением красителей семейства цианинов (рис. 1c из Tillberg et al., 2016). Красители семейства цианинов, такие как Cy3, Cy5 и Alexa Fluor 647, разлагаются во время реакций полимеризации. Соответственно, для дально-красных красителей мы рекомендуем Atto 647N или CF 633.

4: Exfish для культивируемых клеток

ExFISH позволяет проводить экспансионную микроскопию РНК с помощью низкомолекулярного линкера, который мы называем LabelX, для ковалентного прикрепления эндогенных молекул РНК в образцах к набухающему гелю ExM. LabelX аналогичен AcX в proExM, но позволяет опрашивать молекулы РНК после расширения с помощью РНК FISH. Для обработанных ExFISH культивируемых клеток для окрашивания молекул РНК после размножения используют одномолекулярный FISH (smFISH).

Материалы

  • Физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS Current Protocols, 2001)
  • 10% нейтральный забуференный формалин (NBF EMS, кат. № 15742-10)
  • 70% (об. / Об.) Этанола в воде, свободной от нуклеаз
  • Буфер MOPS (см. Рецепт)
  • LabelX (см. Рецепт)
  • Базовый раствор ВА-044 (см. Рецепт)
  • Источник газообразного азота
  • Буфер для пищеварения (см. Рецепт)
  • Вода без нуклеаз
  • Промывочный буфер для smFISH (WA-10 см. Рецепт)
  • буфер для гибридизации smFISH (см. рецепт)
  • Зонды smFISH: в основном мы используем коммерчески доступные зонды smFISH (например, зонды Stellaris® RNA-FISH от LGC Biosearch Technologies). В качестве альтернативы можно разработать специальные зонды smFISH, конъюгированные с флуорофором по своему выбору (Raj & Tyagi, 2010).
  • Парафильм
  • Контейнер Tupperware (модифицированный, как описано в тексте ниже) как герметичная камера
  • 16-луночные защитные стекла со съемной камерой Culturewell от Grace Bio Labs (Sigma, номер по каталогу GBL112358)
  • Инструмент для снятия покровного стекла камеры (Sigma, кат. № GBL 103259)
  • Вакуумный эксикатор и источник вакуума
  • Стеклянные предметные стекла толщиной 1 мм
  • Каптоновая лента или скотч
  • Инкубатор 60 ° C
  • Лезвие бритвы
  • Алмазный писец для резки (разметки) тонкого стекла
  • Щипцы
  • 4-луночные прямоугольные планшеты Nunc (например, Thermo Fisher, каталожный номер 267061)
  • Эпоксидный клей

Подготовка клеточной культуры

Клетки можно выращивать по желанию в соответствии с экспериментальными потребностями. Тем не менее, для простоты гелеобразования и визуализации, а также обработки мы обнаружили, что 16-луночные защитные стекла со съемной камерой Culturewell от Grace Bio Labs (Sigma, каталожный номер GBL112358) удобны для флуоресценции перед расширением. на месте визуализация гибридизации (ExFISH), а также последующее гелеобразование и расщепление. В случаях, когда однокомолекулярный FISH (smFISH) проводится до гелеобразования и размножения, мы обнаружили, что удобно помещать клетки в 8-луночные покровные стекла с камерами Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, номер по каталогу 155411).

Фиксация и проницаемость культивируемых клеток

1. Вымойте клетки один раз PBS, нагретым до 37 ° C, чтобы избежать теплового шока.

2. Добавьте 10% нейтральный забуференный формалин и зафиксируйте клетки в течение 10 мин при комнатной температуре (все этапы выполняются при комнатной температуре, если не указано иное). Дважды промыть PBS, каждый раз по 2 мин при комнатной температуре.

3. Замените буфер 70% (об. / Об.) Этанолом в воде, свободной от нуклеаз, для повышения проницаемости. Фиксированные клетки можно хранить в 70% (об. / Об.) Этаноле в воде, свободной от нуклеаз, при 4 ° C до 2 недель. Для немедленного использования фиксированные клетки должны быть проницаемы с 70% (об. / Об.) Этанолом в воде, свободной от нуклеаз, в течение 1 часа при комнатной температуре.

LabelX обработка культивированных клеток

4. Регидратируйте клетки, проницаемые с помощью 70% (об. / Об.) Этанола, в воде, свободной от нуклеаз, путем двукратной промывки PBS в течение 5 мин на промывку при комнатной температуре. Предварительно инкубируйте фиксированные культивированные клетки с 20 мМ буфера MOPS в течение 5 мин.

5. Подготовьте LabelX, как описано в разделе «Реагенты и растворы», а затем разведите в 20 мМ буфере MOPS до желаемой концентрации.

Мы наблюдали почти полное удержание РНК при использовании LabelX при конечной концентрации амина Label-IT 0,006 мг / мл. Для экспериментов smFISH мы рекомендуем использовать конечную концентрацию амина Label-IT 0,006 мг / мл (т. Е. Разведение 1: 150 от исходного раствора LabelX, описанное в рецепте в разделе «Реагенты и растворы»).

6. Удалите буфер MOPS для предварительной инкубации и добавьте LabelX в буфере MOPS к фиксированным культивированным клеткам. Для клеток, выращенных в покровном стекле съемной камеры, используйте 80 мкл LabelX в буфере MOPS. Для клеток, выращенных в покровных стеклах Nunc Lab-Tek, используйте объем 120 мкл. Инкубируйте в течение ночи при 37 ° C. После этого дважды промойте PBS при комнатной температуре по 5 мин.

На этом этапе клетки можно временно хранить при 4 ° C в PBS до недели.

Гелеобразование

Защитное стекло съемной камеры Grace имеет верхнюю структуру, которую можно снять с помощью инструмента для снятия защитного стекла камеры (Sigma, каталожный номер GBL 103259). После удаления камеры с покровным стеклом остается силиконовая прокладка толщиной 1 мм, которую можно использовать для заливки геля (протокол описан ниже, а также в основном протоколе 2). Если клетки растут на покровном стекле, то камера может быть сделана с использованием спейсеров для покровного стекла (см. Основной протокол 2). Если клетки выращивают в покровных стеклах Nunc Lab-Tek с камерами, мы обнаружили, что нижнее покровное стекло вместе с его 1-миллиметровой прокладкой можно удалить с остальной части планшета и использовать для заливки геля.

Гелеобразование фиксированных культивируемых клеток для ExFISH отличается от гелеобразования других вариантов ExM, поскольку VA-044 вместо APS используется в качестве инициатора полимеризации. Мы обнаружили, что использование APS / TEMED дает тусклый автофлуоресцентный фон, который важен в контексте smFISH, где сами сигналы чрезвычайно тусклые. VA-044 предпочтительнее, потому что его использование приводит к минимальной автофлуоресценции, что идеально для визуализации smFISH. Однако VA-044 имеет более высокую температуру разложения и приводит к более медленному процессу полимеризации. В результате ингибирование из-за окружающего кислорода может повлиять на гелеобразование. Мы обнаружили, что дегазация с последующей перфузией азотом вытесняет кислород, растворенный в гелеобразующем растворе, и способствует образованию геля. Поэтому гелеобразование проводят в атмосфере азота в увлажненной камере, которая обеспечивает среду, заполненную азотом, и сводит к минимуму испарение.

Обычно мы используем контейнер Tupperware, но любой контейнер, обеспечивающий герметичное уплотнение, можно использовать для увлажненной камеры (рис. 7). Делаем два отверстия в крышке Tupperware с помощью иглы для шприца. Для увлажнения камеры на дно посуды добавляем небольшое количество воды. Мы размещаем пустую пластиковую пластину с 24-луночным дном в самом низу Tupperware, чтобы обеспечить приподнятую платформу, на которую мы помещаем покровное стекло с клетками и гелеобразующим раствором, уровень воды должен быть намного ниже, чем высота 24-луночного. пластину так, чтобы желируемый образец держался над водой.

7. Для защитного стекла съемной камеры Grace: Используйте инструмент для снятия покровного стекла камеры, чтобы удалить верхние колодцы, оставив черную силиконовую прокладку. Оставьте 40 мкл PBS внутри лунки, чтобы клетки оставались гидратированными. Для покровного стекла Lab-Tek с камерой сначала приклейте нижнюю часть покровного стекла к предметному стеклу микроскопа толщиной 1 мм для механической поддержки с помощью эпоксидного клея. После того, как клей застынет, используйте лезвие бритвы, чтобы отделить покровное стекло от верхних углублений, оставив пластиковую прокладку. Оставьте 100 мкл PBS внутри лунки, чтобы клетки оставались гидратированными.

8. Приготовьте желирующий раствор для ExFISH следующим образом.

Разведите VA-044 до конечной концентрации 0,5% (мас. / Об.) В растворе мономера (т. Е. Разбавьте исходный раствор 1:50 в растворе мономера). Например, чтобы приготовить 1 мл гелеобразующего раствора, добавьте 20 мкл раствора VA-044 и 40 мкл воды к 940 мкл раствора мономера.

Желирующий раствор следует приготовить при 4 ° C и сразу же использовать на следующем этапе.

9. В холодном блоке или на льду распределите гелеобразующий раствор для ExFISH на аликвоты по 200 мкл в микроцентрифужных пробирках. Дегазация в течение 10 мин в вакуумном эксикаторе.

10. Удалите весь оставшийся PBS из лунок на покровных стеклах и добавьте дегазированный гелеобразующий раствор для ExFISH. Для покровного стекла съемной камеры Grace добавьте 40 мкл гелеобразующего раствора. Добавьте 200 мкл гелеобразующего раствора, если используете покровное стекло Lab-Tek с камерой. Поместите покровное стекло в вакуумный эксикатор и дегазируйте еще 10 мин. Тем временем приготовьте предметное стекло, покрытое парафильмом в качестве крышки (см. Рис. 2 и соответствующий текст выше). Убедитесь, что поверхность Parafilm ровная, чистая и не имеет складок. Parafilm предотвращает прилипание геля к крышке при снятии крышки на более поздних этапах. Снимите покровное стекло с эксикатора и сразу же поместите предметное стекло Parafilm непосредственно поверх покровного стекла. Излишки гелеобразующего раствора могут разлиться в стороны. Без промедления переходите к следующим шагам.

11. Поместите покровное стекло на пластиковую платформу в увлажненной камере. Закройте камеру (рис. 7A, B).

12. Снимите ленту, закрывающую отверстия. Подсоедините вход линии азота к наконечнику шприца и вставьте наконечник через одно отверстие (рис. 7C). Медленно включите регулятор потока азота, чтобы промыть азот в камеру. Увеличивайте поток, пока не почувствуете, как воздушный поток выходит из другого отверстия. Промойте камеру азотом в течение 10 мин. Когда закончите, снимите впускной патрубок и сразу же снова заклейте оба отверстия лентой (например, каптоновой лентой или скотчем).

13. Поместите камеру в инкубатор при 60 ° C на 2 часа, чтобы начать гелеобразование (рис. 7D). Будьте осторожны, не наклоняйте и не трясите камеру во время переноса и гелеобразования.

Пищеварение

14. Когда гелеобразование закончится, выньте увлажненную камеру из инкубатора 60 ° C и снимите покровное стекло. Используя лезвие бритвы, осторожно откройте крышку, покрытую парафильмом, сверху лунок. Для покровного стекла съемной камеры Grace Biolabs аккуратно снимите черную силиконовую прокладку, сняв ее руками или парой щипцов. Для покровного стекла Lab-Tek с камерой не пытайтесь удалить пластиковую прокладку. На этом этапе вы увидите, что гели образовались в отдельных лунках покровного стекла.

15. Для переваривания поместите покровное стекло в 4-луночный прямоугольный планшет Nunc. Подготовьте буфер для разложения с протеиназой K, как описано в разделе «Реагенты и растворы». Добавьте 6 мл буфера для разложения в лунку, содержащую покровное стекло (при использовании любого другого контейнера, добавьте буфер для разложения как минимум в 10 раз больше объема геля, чтобы полностью покрыть покровное стекло и гели).Убедитесь, что гель полностью погружен как минимум на 2–3 часа, пока он естественным образом не отслоится от покровного стекла образца (рис. 2F). Если используется покровное стекло со съемной камерой, используйте алмазную палочку, чтобы отделить каждый образец и соответствующий ему кусок покровного стекла, разметав покровное стекло и отломив каждый кусок стекла с кусочком геля. Обратите внимание, что субстрат для культивирования клеток помещается так, чтобы гель находился наверху субстрата, а культивируемые клетки находились на нижней поверхности геля. Необязательно, отделившийся клеточный субстрат можно осторожно удалить с помощью щипцов, чтобы просто оставить содержащий клетки гель в буфере для переваривания.

16. Оставьте гель погруженным в буфер для разложения на ночь при комнатной температуре в темноте.

Хранение и расширение

17. После переваривания гели можно разложить (временно, см. Ниже) в чашке Петри или любом контейнере, достаточно большом, чтобы вместить гели. Чтобы полностью расшириться, промойте гели лишним объемом воды, свободной от нуклеаз, трижды, по крайней мере, по 1 часу на промывку. Также см. Базовый протокол 1.

SmFISH-окрашивание культивируемых клеток после размножения

18. Поскольку гели, образованные в любом из вышеуказанных покровных стекол с камерами, до расширения имеют толщину ~ 1 мм, толщину расширенных гелей необходимо уменьшить, чтобы облегчить эффективную диффузию зондов FISH через гель. Чтобы сбрить полностью расширенные гели до толщины 1 мм, мы используем предметные стекла для микроскопа толщиной 1 мм в качестве разделителей следующим образом. Приготовьте большую пластиковую тарелку, которую можно использовать в качестве разделочной доски. Мы часто используем пластиковые крышки 4-луночных прямоугольных планшетов Nunc, хотя подойдет любая плоская пластиковая поверхность аналогичного размера. С помощью небольшого количества эпоксидной смолы приклейте два предметных стекла толщиной 1 мм на их плоское предметное стекло к пластиковой поверхности. Расположите два предметных стекла таким образом, чтобы они были выровнены по их наибольшему размеру с промежутком от 2,5 до 3 см между ними. Дайте эпоксидной смоле затвердеть.

19. Поместите полностью расширенный гель между двумя предметными стеклами на пластиковой крышке. Расширенный гель должен поместиться между двумя предметными стеклами. Если нет, обрежьте гель лезвием бритвы. Расположите гель так, чтобы сторона геля с культивированными клетками была обращена ко дну.

20. Поместите лезвие бритвы по стеклянным предметным стеклам так, чтобы оно перекрывало предметные стекла. Осторожно проведите лезвием бритвы по предметным стеклам и сквозь гель, чтобы сбрить все, кроме нижнего 1 мм геля, содержащего клетки.

21. Осторожно соберите сбритый гель на дне, содержащий фиксированные и разросшиеся клетки, и переместите его в PBS. При необходимости на этом этапе гели для бритья можно хранить в PBS при 4 ° C до 1 месяца.

22. Приступите к окрашиванию smFISH, которое можно проводить в любом контейнере, хотя мы часто используем 24-луночные планшеты со стеклянным дном для удобства визуализации сразу после окрашивания.

23. Подготовьте гели, инкубируя с промывочным буфером (WA-10) в течение 30 минут при комнатной температуре.

24. Подготовьте зонды путем разбавления в буфере для гибридизации smFISH в концентрации, указанной производителем для smFISH. Обычно мы проводим гибридизацию при общей концентрации зонда 100 нМ. Перемешать на вортексе.

25. Удалите промывочный буфер с гелей. Добавьте гибридизационный буфер с зондами на гели. Добавьте достаточный объем, чтобы полностью покрыть гель для окрашивания (для 24-луночных планшетов мы рекомендуем 300 мкл). Инкубируйте в течение ночи (или более 6 часов) при 37 ° C.

26. Дважды промойте гели избыточным объемом (например, 500 мкл для 24-луночных планшетов) WA-10 при 37 ° C по 30 минут на промывку.

27. Один раз промыть избыточным объемом PBS при 37 ° C в течение 30 мин.

28. Визуализация может быть выполнена в PBS или любом другом буфере по выбору [коэффициент расширения определяется концентрацией соли: использование обычного PBS приводит к ~ 2-кратному расширению с использованием 0,02-кратного PBS (разбавленного в воде) приводит к ~ 3-кратному расширению при сохранении гибридизация].

Пример с клетками HeLa показан на рисунке 8. Обратитесь к основному протоколу 6 для получения информации о том, как получать изображения расширенных гелей в наиболее распространенных настройках микроскопа. Хотя качество полученного изображения будет зависеть от настройки визуализации, получение изображений с широким полем обычно рекомендуется вместо конфокальной визуализации из-за фотообесцвечивания пятен smFISH, наблюдаемого во время конфокальной визуализации.

Протокол выполнения ExFISH в тканях отличается от протокола культивирования клеток в нескольких ключевых аспектах. Во-первых, протокол ExFISH тканей требует усиления сигнала после выполнения FISH, потому что обычный smFISH слишком тусклый для конфокальной визуализации и аналогичных методов трехмерной визуализации, необходимых для тканей. В результате мы используем цепную реакцию гибридизации (HCR) для усиления сигнала от зондов FISH. Во-вторых, процедура гелеобразования больше похожа на процедуру, описанную в протоколе proExM для тканей (Базовый протокол 2), чем на процедуру для культивируемых клеток. В-третьих, используются более высокие концентрации LabelX, поскольку при более высоких концентрациях в тканях наблюдается лучший выход РНК. Наконец, после обработки Label-X можно использовать AcX для удержания флуоресцентных белков.

Материалы

  • Вода без нуклеаз
  • Физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS Current Protocols, 2001)
  • 4% (мас. / Об.) Параформальдегида (PFA) в PBS
  • 70% (об. / Об.) Этанола в воде, свободной от нуклеаз
  • Буфер MOPS (см. Рецепт)
  • LabelX (см. Рецепт)
  • Промывочный буфер для HCR-FISH (WA-20 см. Рецепт)
  • Буфер для гибридизации HCR-FISH (см. Рецепт)
  • Конструкция зонда HCR-FISH: зонды для HCR-FISH разработаны с использованием программного обеспечения Stellaris Probe Designer от LGC Biosearch Technologies. Последовательности связывания длиной 22 п.н., разнесенные на 2 п.н., созданы с использованием программного обеспечения. Мы часто стремимся получить не менее 20 последовательностей, нацеленных на каждый интересующий транскрипт. Для создания зондов HCR-FISH последовательности инициатора HCR (Choi, Beck, & Pierce, 2014) добавляются к каждой связывающей последовательности через спейсер из 2 оснований (AA). Последовательности инициатора могут быть присоединены к 5'-концу или 3'-концу каждой связывающей последовательности в зависимости от ориентации инициаторных последовательностей. Инициаторы I1 присоединяются к 5'-концу, а инициаторы I2 присоединяются к 3'-концу. Конечная длина зондов HCR-FISH, полученных с помощью этой процедуры, составляет 60 п.н.
  • Буфер для амплификации (см. Рецепт)
  • Шпильки HCR (приобретаются у Molecular Instruments, каждая шпилька поставляется с концентрацией 3 мкМ в буфере для хранения)
  • 5 × SSCT (см. Рецепт) и 0,05 × SSCT (см. Рецепт)
  • Вибратом
  • 24-луночные культуральные планшеты
  • Дополнительные реагенты и оборудование для транскардиальной перфузии (Chen et al., 2015), разрезания вибратома (Chen et al., 2015) и proExM для интактных тканей (Основной протокол 2)

Фиксация и нарезка тканей

Ткани можно зафиксировать с помощью протоколов по вашему выбору. Ниже приведен протокол перфузионной фиксации и срезов для срезов мозга мыши, который продемонстрировал стабильные результаты.

1. Транскардиально перфузируйте мозг мыши (Chen et al., 2015) ледяным PBS (от 5 до 10 мл), а затем ледяным 4% (мас. / Об.) Параформальдегидом в PBS (~ 30 мл).

2. Постфиксируйте мозг в 4% (мас. / Об.) Параформальдегиде в PBS в течение ночи при 4 ° C.

3. Промойте мозг PBS один раз в течение 30 минут, прежде чем разрезать срезы.

4. Нарежьте срезы мозга на вибратоме (Chen et al., 2015) в PBS.

Толщина срезов должна быть менее 200 мкм, чтобы обеспечить эффективное окрашивание зондами FISH после расширения.

5. Срезы можно хранить в PBS, если они используются немедленно (в течение 1-2 дней), или хранить в 70% (об. / Об.) Этаноле в воде, свободной от нуклеаз, в течение более длительного времени при 4 ° C.

LabelX обработка, гелеобразование и переваривание тканей и срезов тканей

6. Если ткани или срезы тканей хранились в 70% (об. / Об.) Этаноле в воде, свободной от нуклеаз, проведите регидратацию путем двукратной промывки PBS в течение 15 минут для каждой промывки при комнатной температуре. В противном случае продолжите оставшуюся часть протокола.

7. Предварительно инкубируйте ткани или срезы тканей с 20 мМ буфера MOPS в течение 30 мин.

8. Подготовьте LabelX, разбавив 20 мМ буфера MOPS до конечной концентрации амина Label-IT 0,1 мг / мл (т.е. разведение 1:10 из исходного раствора LabelX).

9. Удалите буфер MOPS для предварительной инкубации и добавьте в срезы LabelX в буфере MOPS. Для удобства ткани или срезы тканей можно обрабатывать в 24-луночных или 48-луночных планшетах. Используйте достаточный объем, чтобы покрыть срезы: например, в 24-луночном планшете четыре среза по 50 мкм можно инкубировать вместе в 250 мкл раствора.

10. Инкубируйте ткани или срезы тканей с LabelX в MOPS в течение ночи при 37 ° C. После этого дважды промойте PBS по 15 мин за раунд.

11. По желанию: Чтобы сохранить флуоресцентные белки в срезах тканей трансгенных образцов, можно провести дополнительную инкубацию с AcX. Инкубируйте срезы с 0,05 мг / мл AcX в PBS при комнатной температуре не менее 6 часов. Дважды промыть PBS по 15 мин на каждую стирку.

12. Приступите к гелеобразованию и расщеплению, как описано в Основном протоколе 2.

В отличие от процедуры гелеобразования ExFISH для культивируемых клеток, здесь гелеобразование с помощью APS / TEMED можно проводить, как в протоколе proExM, поскольку усиление сигнала с помощью HCR делает тусклую автофлуоресценцию, возникающую из APS / TEMED, незначительной.

13. После переваривания промойте гели PBS дважды, каждый раз по 30 мин. Гели можно хранить в темноте в PBS при 4 ° C после этого этапа до 2 месяцев.

Окрашивание гелеобразных ломтиков с помощью HCR-FISH

Хотя окрашивание можно проводить в любой камере, мы часто используем 24-луночные планшеты.

14. Подготовьте гели, инкубируя с промывочным буфером (WA-20) в течение 30 минут при комнатной температуре.

15. Подготовьте зонды, разбавляя гибридизационным буфером HCR-FISH до желаемой концентрации (~ 1 нМ на зонд). Перемешать на вортексе.

16. Удалите промывочный буфер с гелей. Добавьте гибридизационный буфер с зондами на гели. Добавьте достаточный объем, чтобы полностью покрыть гель для окрашивания (для 24-луночных планшетов, 300 мкл на лунку). Инкубируйте в течение ночи при 37 ° C.

17. Дважды промойте гели избыточным объемом (например, 500 мкл для 24-луночных планшетов) WA-20 при 37 ° C в течение 30 минут на каждую промывку. Для срезов толщиной более 100 мкм до образования геля увеличьте время промывки до 45 минут на одну промывку.

18. Промыть один раз избыточным объемом PBS при 37 ° C в течение 2 часов.

19. Один раз промойте избыточным объемом PBS при комнатной температуре в течение 2 часов. Для срезов толщиной более 100 мкм до образования геля увеличьте время промывки до 4 часов. При необходимости после этого этапа гели, окрашенные зондами FISH, можно хранить в течение ночи в PBS при 4 ° C перед амплификацией HCR.

Амплификация HCR (адаптировано из Choi et al., 2014)

20. Предварительно инкубируйте срезы с буфером для амплификации в течение 30 мин при комнатной температуре.

21. Подготовьте шпильки с флуоресцентной меткой, охладив каждую шпильку (нагрейте до 95 ° C в течение 90 секунд, затем охладите до комнатной температуры в выдвижном ящике в течение 30 минут). На каждые 500 мкл общего используемого буфера для амплификации (на следующем этапе мы используем 150 мкл буфера для амплификации на лунку 48-луночного планшета или 250 мкл на лунку 24-луночного планшета) необходимо 10 мкл каждой шпильки. .

22. Приготовьте раствор шпильки, объединив все шпильки с быстрым охлаждением в буфере для амплификации при комнатной температуре, используя правильный объем буфера для амплификации, чтобы получить желаемый конечный объем. Например, чтобы приготовить 500 мкл общего буфера для амплификации с двумя шпильками, добавьте 10 мкл каждой шпильки к 480 мкл буфера для амплификации. Перемешать на вортексе.

23. Удалите раствор для предварительной амплификации, добавьте раствор шпильки в гели и инкубируйте от 3 до 6 часов при комнатной температуре.

24. Остановите амплификацию четырьмя 30-минутными промываниями с 5 × SSCT.

Расширение и визуализация

25. На этом этапе можно визуализировать образцы. Чтобы расширить образцы, промойте три раза, каждый раз по 10 мин с 0,05 × SSCT. Коэффициент расширения может быть настроен путем изменения изображения концентрации соли, которое также может быть выполнено в обычном PBS для ~ 2-кратного расширения. Пример среза мозга мыши показан на рисунке 9. Обратитесь к основному протоколу 6, чтобы узнать, как получить изображение расширенных гелей в наиболее распространенных настройках микроскопа.

6. Образцы с расширенным изображением

Материалы

  • Расширенный образец (см. Протоколы выше)
  • Спирт этиловый
  • РЫБНЫЕ зонды
  • 0,1% (мас. / Об.) Поли-L-лизина в воде
  • Источник азота
  • Агароза с низкой температурой плавления
  • Супер клей
  • Рассекающий или широкопольный микроскоп
  • Лезвие бритвы
  • Покровные стекла (например, 24 × 60 мм № 1,5 (толщина: от 0,15 до 0,19 мм))
  • Чашки со стеклянным дном или многолуночные планшеты (например, Mattek, номер по каталогу P35G-0.170-14-C)
  • Кисть
  • Бумажные салфетки (например, Kimwipes)
  • Инвертированный, прямой или световой микроскоп

Расширение образца для визуализации

1. Поместите залитый в гель переваренный образец в PBS (например, шаг 30 Базового протокола 1, конец шага 25 Базового протокола 2, шаг 17 Базового протокола 4 или шаг 13 Базового протокола 5) в чашку Петри. .

2. Используйте диссекционный микроскоп или широкопольный микроскоп с малым увеличением (например, 4 или 10), чтобы найти интересующую область.

Для образцов ExFISH это следует сделать перед окрашиванием зондами FISH (т.е. перед этапом 18 Базового протокола 4 или перед этапом 14 Базового протокола 5).

3. Под микроскопом используйте лезвие бритвы, чтобы удалить излишки геля (например, вдали от интересующей области).

Образцы культивированных клеток ExFISH также могут нуждаться в обрезке в осевом направлении для уменьшения толщины (см. Шаги с 18 по 21 в Основном протоколе 4).

4. Полностью наполните образцы proExM водой. Образцы ExFISH должны быть окрашены зондами FISH и размножены в разбавленном PBS для культивируемых клеток или в разбавленном буфере SSC для тканей в соответствии с протоколами, описанными ранее (т. Е. Шаги с 22 по 28 Базового протокола 4 или шаги с 14 по 25 Базового протокола 5. ).

Образец монтажа

Установка расширенного образца ExM на устойчивой поверхности может помочь предотвратить смещение образца во время визуализации, что важно для получения высококачественных изображений. Наилучший метод установки будет зависеть от геометрии вашего микроскопа и держателя образца (например, покровное стекло, чашка Петри или лунка многолуночного планшета), а также от ваших требований к визуализации, таких как время визуализации, тип объектива и увеличение.

Для быстрого осмотра (<5 мин) расширенных образцов с использованием перевернутого или вертикального микроскопа с сухим объективом обычно нет необходимости в установке образца. Вы можете использовать пипетку, чтобы временно (<5 мин) удалить жидкость вокруг геля, чтобы она не всплыла или не соскользнула.

Для долгосрочной (> 5 мин) визуализации или визуализации, требующей минимального смещения образца (например, получение z-stack), вы можете установить образец, физически прикрепив расширенные образцы к держателю образца. В следующих разделах мы описываем три распространенных метода крепления: агароза, поли-L-лизин и суперклей. В инвертированных микроскопах вы можете использовать поли-L-лизин для закрепления геля на устойчивой поверхности. Для вертикальных микроскопов можно использовать агарозу, поли-L-лизин или суперклей. Для световых микроскопов вы можете использовать суперклей или поли-L-лизин.

Преимущество метода поли-L-лизина заключается в том, что он обеспечивает прозрачную границу раздела между гелем и поверхностью держателя образца. Следовательно, он подходит для конфигураций микроскопов, требующих получения изображений через держатель образца, например инвертированного микроскопа. Для сравнения, агароза может привести к оптическому рассеянию и аберрации, а суперклей непрозрачен после отверждения. Преимущество метода агарозы заключается в том, что вы можете извлечь образец после визуализации, поскольку установка образца является обратимой. Образец можно уменьшить (а затем отделить от агарозы), поместив в буфер с высоким содержанием соли после визуализации. Преимуществом метода суперклея является его сильная адгезия по сравнению с другими методами. Он подходит для долгосрочной визуализации на прямом микроскопе или световом микроскопе даже в течение нескольких дней.

Крепление образца с поли-L-лизином

5а. В качестве держателей образцов можно использовать покровные стекла, чашки со стеклянным дном и многолуночные планшеты со стеклянным дном. Также можно использовать предметные стекла или пластиковые многолуночные планшеты, но толщина держателя образца может ограничивать выбор объективов и / или вызывать аберрации на инвертированных микроскопах.

6а. Очистите поверхность держателя образца, промыв водой, а затем этанолом. После ополаскивания дайте держателю высохнуть на воздухе.

7а. Погрузите стеклянную поверхность в воду с 0,1% (мас. / Об.) Поли-L-лизином на 20 мин.

8а. Удалите 0,1% (мас. / Об.) Раствор поли-L-лизина и трижды промойте поверхность стекла с покрытием водой.

9а. Высушите стеклянную поверхность на воздухе в течение 1 часа в чистой среде или высушите поверхность с помощью газообразного азота.

  1. Сначала удалите большую часть жидкости вокруг геля. Затем поместите чистое покровное стекло рядом с гелем и с помощью кисти нанесите гель на покровное стекло.
  2. Затем извлеките покровное стекло (с гелем наверху) из контейнера с помощью пинцета.
  3. Перед переносом геля на поверхность, модифицированную поли-L-лизином, поверхность геля, которую необходимо прикрепить, необходимо высушить для хорошей адгезии. Вы можете использовать небольшой кусочек салфетки Kimwipe, чтобы удалить лишнюю жидкость. Начните абсорбировать лишнюю жидкость со сторон геля, а затем осторожно используйте, например, кончик бумажной салфетки, чтобы впитать жидкость между дном геля и покровным стеклом.

Используйте кисть, чтобы сдвинуть гель с покровного стекла на поверхность, модифицированную поли-L-лизином. Помните об ориентации геля в контексте вашей более поздней микроскопии: например, сторона, обращенная к держателю образца, будет легче достигнута объективом (например, в пределах рабочего расстояния объектива) в перевернутой установке. Напротив, в вертикальной установке микроскопа сторона, обращенная от держателя образца, будет более доступной для объектива. Поэтому, если интересующая область находится ближе к одной конкретной стороне геля, поместите эту сторону ближе к объективу при установке образца. Эта практика становится важной для расширенных образцов, поскольку толщина образца и толщина геля увеличиваются на коэффициент расширения.

Этот перенос геля следует проводить своевременно, чтобы избежать обезвоживания геля: мы рекомендуем завершить этот шаг в течение 5 минут.

11а. После монтажа немедленно добавьте небольшое количество воды (или разбавленного PBS для образцов ExFISH), чтобы гель оставался гидратированным и избегал усадки геля.

Крепление образца с агарозой

5б. В качестве держателей образцов можно использовать покровные стекла, чашки со стеклянным дном и многолуночные планшеты со стеклянным дном. Также можно использовать предметные стекла или пластиковые многолуночные планшеты, но толщина держателя образца ограничит выбор объективов и / или вызовет аберрации на инвертированных микроскопах.

6б. Подготовьте 0,5% (мас. / Об.) Раствор агарозы с низкой температурой плавления в подходящей среде для визуализации. Например, для образцов proExM приготовьте 0,5% (мас. / Об.) Агарозы в воде. Для образцов ExFISH приготовьте 0,5% (мас. / Об.) Агарозы в разбавленном PBS или другом буфере по вашему выбору. Держите раствор агарозы теплым на водяной бане с температурой 40 ° C, чтобы избежать преждевременного затвердевания. Если он затвердеет, используйте короткий цикл микроволновой печи (от 10 до 20 секунд), чтобы расплавить раствор агарозы. В качестве альтернативы, нагревая его до ~ 60 ° C, он также снова расплавится.

7b. Перенесите вспученный гель в держатель образца по выбору (например, в покровные стекла и чашки со стеклянным дном). Во время переноса удалите и удалите жидкость из расширенного геля (см. Шаг 10а выше).

8b. С помощью пипетки аккуратно нанесите раствор расплавленной агарозы на края геля.При необходимости можно также залить весь гель в агарозе, используя раствор расплавленной агарозы.

9b. Подождите, пока агароза затвердеет при комнатной температуре или при 4 ° C, а затем добавьте небольшое количество воды (или разбавленный PBS для образцов ExFISH), чтобы предотвратить обезвоживание.

10б. После завершения визуализации вы можете поместить установленный образец в буфер с высоким содержанием соли, такой как PBS. Это приведет к усадке геля, но не агарозы. Используя кисти или щипцы, вы можете отделить гель от агарозы. Затем гель можно хранить в PBS для дальнейшего использования.

Образец крепления суперклеем

5c. В качестве держателей образцов можно использовать покровные стекла, чашки со стеклянным дном и многолуночные планшеты со стеклянным дном. Также можно использовать предметные стекла или пластиковые многолуночные планшеты. Однако, поскольку суперклей становится непрозрачным после отверждения, этот метод крепления несовместим с инвертированными микроскопами, которые требуют визуализации через держатель образца.

6c. Очистите поверхность держателя образца, промыв водой, а затем этанолом. После ополаскивания дайте держателю высохнуть на воздухе.

7c. Нанесите суперклей на поверхность держателя образца. Наносите клей только на то место, где должен быть нанесен гель. Также убедитесь, что излишки суперклея удаляются бумажными салфетками, оставляя только тонкий слой.

8c. Перенесите вспученный гель в держатель образца по выбору. Перед переносом удалите и удалите жидкость из расширенного геля (см. Шаг 10а).

9c. После того, как гель нанесен на клей, подождите 20–30 секунд, пока суперклей не затвердеет, прежде чем добавлять воду (или разбавленный PBS для образцов ExFISH) для гидратации геля.

После отверждения между гелем и суперклеем должна остаться непрозрачная поверхность.

Получение изображений образцов ExM с помощью инвертированных микроскопов (например, конфокальных микроскопов с инвертированным вращающимся диском)

Типичная установка инвертированного микроскопа показана на рисунке 10. Метод крепления поли-L-лизина рекомендуется для инвертированных микроскопов, поскольку прозрачная граница раздела между гелем и поверхностью, модифицированной поли-L-лизином, позволяет получать изображения через держатель образца.

Для визуализации на инвертированном микроскопе мы рекомендуем начать с объективов с малым увеличением (4 × или 10 ×), чтобы сначала найти интересующую область, а затем переключиться на объективы с большим увеличением. Воздушные объективы, как правило, представляют собой объективы с малым увеличением (например, 4-кратное или 10-кратное) и могут использоваться вначале для поиска образцов и интересующих областей. Для получения изображений с большим увеличением (& gt20 ×) мы рекомендуем использовать водно-иммерсионные объективы, чтобы избежать аберраций, вызванных несоответствием показателей преломления между водной монтажной средой и покровным стеклом или маслом. Из-за в целом коротких рабочих расстояний масляно-иммерсионные объективы могут рассматриваться для использования, главным образом, когда расширенный гель устанавливается близко (в пределах ~ 10 мкм) к покровному стеклу и когда образец или интересующий объект находится близко к объективу (например, в культивируемых клетках или тонких тканях). Рабочее расстояние объектива обычно не является проблемой для тонких образцов, таких как культивируемые клетки, если гель правильно установлен на держателе образца (т. Е. Сторона образца геля установлена ​​лицом к стороне объектива с использованием поли-L - лизиновый метод). Однако для некоторых образцов ткани рабочее расстояние становится проблемой при визуализации вглубь геля (например, & gt300 мкм). В этом случае рекомендуется использовать водно-иммерсионные объективы с большим рабочим расстоянием. Как и при любом микроскопическом эксперименте, убедитесь, что корректирующая манжета на объективе (если применимо) отрегулирована в соответствии с толщиной покровного стекла.

Многие из широкоугольных и конфокальных микроскопов, используемых в биологических лабораториях и средствах визуализации, являются инвертированными микроскопами. Мы обнаружили, что конфокальные микроскопы с вращающимся диском предлагают хорошее сочетание разрешения и скорости и очень подходят для быстрой наномасштабной визуализации расширенных тканей. Конфокальные микроскопы с лазерным сканированием могут наиболее эффективно использоваться для получения изображений с высоким отношением сигнал-фон тонких и малых образцов, таких как культивируемые клетки.

Получение изображений с помощью вертикальных микроскопов

Для вертикальных микроскопов можно использовать любой из трех способов крепления: поли-L-лизин, агароза или суперклей. Если вы планируете забрать образец после визуализации, мы рекомендуем метод крепления на агарозе. В двух других методах гель физически прикреплен к держателю образца, но потенциально может быть отрезан лезвием бритвы, если образец необходимо извлечь (обратите внимание, что этот процесс может повредить образец, если вы не будете осторожны). Для долговременной визуализации (например, в течение нескольких дней) мы рекомендуем использовать метод крепления суперклеем, так как он обеспечивает самую прочную адгезию к держателю образца. Метод поли-L-лизина дает прозрачную границу раздела между гелем и держателем образца и, таким образом, также может быть отображен в инвертированном микроскопе. Для получения изображений на вертикальном микроскопе мы рекомендуем начать с объективов с малым увеличением (4 × или 10 ×), чтобы сначала найти интересующую область, а затем переключиться на объективы с большим увеличением, что аналогично процедуре на инвертированном микроскопе. Для получения изображений с большим увеличением (& gt20 ×) мы рекомендуем использовать водно-погружные или водно-иммерсионные объективы, поскольку гель погружен в водную монтажную среду.

Получение изображений с помощью микроскопов с образцом, свисающим сверху (например, световые микроскопы)

Световые микроскопы подходят для получения изображений расширенных образцов тканей на высоких скоростях с использованием объективов с большим рабочим расстоянием. Чтобы разместить объективы, некоторые световые микроскопы вешают образцы сверху. Например, типичная установка светового микроскопа для получения изображений (световой микроскоп Zeiss Z.1) показана на рисунке 11. В световом микроскопе Z.1 для подвешивания образцов над объективами перпендикулярно к ним используется стержень. световой путь микроскопа. Затем образец помещают в камеру для визуализации, заполненную водной монтажной средой. Для расширенных образцов ExM тонкое покровное стекло можно использовать в качестве основы для физической поддержки геля, а затем основу покровного стекла можно прикрепить к стержню через небольшой адаптер с трехмерной печатью, который доступен для загрузки на нашем веб-ресурсе. http://expansionmicroscopy.org. Чтобы прикрепить гель к подложке покровного стекла, мы рекомендуем метод крепления суперклеем, так как он наиболее прочно прикрепляет гель к покровному стеклу. Монтаж из поли-L-лизина также можно использовать для краткосрочной визуализации, но мы наблюдали отслоение геля, если монтаж не выполняется должным образом (например, из-за просроченного поли-L-лизина, быстрых движений предметного столика или недостаточного количества воды. удаление из геля перед нанесением). После нанесения геля на подложку покровного стекла подложку можно прикрепить к адаптеру с помощью суперклея. Адаптер разработан таким образом, чтобы соответствовать вмятинам на конце стержня, поэтому его можно механически закрепить на стержне.

В световых микроскопах Zeiss Z.1 мы обычно используем водно-иммерсионный объектив с числовой апертурой 1.0 NA и 20-кратным увеличением рабочего расстояния для получения изображений с высоким разрешением. Если объем изображения большой и требует длительного времени, мы можем использовать объективы с меньшим увеличением (5 ×), чтобы получить быстрый обзор образца с низким разрешением. Световой микроскоп Z.1 подходит для визуализации больших многоцветных образцов с помощью двухкамерной установки, быстрого получения изображения и возможности одновременного захвата двух цветовых каналов. Кроме того, большое рабочее расстояние объектива можно использовать для получения изображений больших прозрачных образцов. Эти характеристики светового микроскопа Z.1 особенно полезны для визуализации образцов ExM.

Сначала мы продемонстрировали эти преимущества, визуализировав объем ~ 575 × 575 × 160 мкм (~ 6 × 10 10 вокселей в трех цветах) образца HCR-ExFISH примерно за ~ 3 часа, с разрешением, способным разрешить отдельные точки РНК в пределах расширенная ткань (рис. 11D-F Chen et al., 2016). С помощью этой системы были успешно получены изображения даже более крупных образцов в миллиметровом диапазоне. Один из таких примеров показан на фиг. 11G, на которой подобласть гиппокампа мыши, инфицированная вирусом Brainbow 3.0 AAV (фиг. 5), была расширена с помощью протокола proExM, описанного ранее. Объем изображения составлял ~ 1,5 × 0,8 × 0,1 мм в единицах предварительного расширения, а набор данных требовал сшивания 180 отдельных стопок трехмерных изображений, в результате чего получился набор данных размером 5 терабайт, 0,7 теравокселя с эффективным поперечным размером пикселя около 60 нм. .


Приготовление лизата: почему RIPA-буфер лучше всего подходит для вестерн-блоттинга?

В 1979 году Хайме Ренарт и др. опубликовала статью под названием «Перенос белков из гелей на диазобензилоксиметилбумагу и обнаружение с помощью антисыворотки: метод изучения специфичности антител и структуры антигена», ставшую прелюдией к современной методике вестерн-блоттинга (WB).

Вскоре после этого Гарри Тобин и др. пошел еще дальше и опубликовал «Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозные листы: процедура и некоторые применения». Так и родилась техника WB.

Сегодня эксперименты ВБ являются краеугольным камнем биологических исследований. К сожалению, часто бывает сложно получить хорошие результаты.

Один мудрец однажды сказал:

Успешный ВБ полагается на:

Говоря о WB, как о оригинальном производителе всех наших продуктов, сотрудники отдела исследований и разработок Proteintech тестируют в среднем более 70 образцов для каждого продукта в WB. Старшие сотрудники Proteintech по исследованиям и разработкам поделятся с вами своим многолетним опытом работы с ВБ, чтобы гарантировать, что каждый ВБ будет успешным.

Что входит в раствор для лизиса?

Лизирующий раствор содержит следующие компоненты:

1. В буферная система

Уровень pH раствора имеет решающее значение. Белки могут выпадать в осадок или становиться нестабильными, когда pH выходит за пределы физиологического диапазона. Чтобы избежать этой ситуации, рекомендуется использовать буферную систему, такую ​​как Трис-HCl. Помимо буферных растворов в этом диапазоне, буфер Tris-HCl сохраняет физиологическую ионную силу и предотвращает образование нерастворимых продуктов с другими ионами. Другой вариант - система буферизации HEPES. Мы рекомендуем избегать буферов с высокими концентрациями калия, поскольку они могут осаждать белки, когда присутствует додецилсульфат натрия (SDS).

2. Ионы соли

Когда концентрация солевых ионов слишком высока, некоторые белки могут выпадать в осадок. Кроме того, когда концентрация ионов слишком высока, может возникнуть «улыбающееся лицо» миграции полосы.

3. Хаотропные агенты

Хаотропные агенты ослабляют гидрофобность белков, чтобы солюбилизировать их. В буфере для лизиса есть два типа хаотропных агентов:

а. Мочевина / тиомочевина. Эти молекулы распутывают гидрофобные области, разрывая водородные связи между аминокислотами. Обычно при экстракции белка для ВБ можно использовать 6–8 М мочевину и / или 2 М тиомочевину.

б. Моющие средства. Это широкий класс поверхностно-активных веществ. Ключом к их растворяющей способности является их амфифильная структура. Гидрофобный конец связывается с гидрофобными частями белков, в то время как гидрофильный конец взаимодействует с водой, что приводит к солюбилизации.

Ионные детергенты можно разделить на катионные, анионные и амфотерные. Обычными ионными поверхностно-активными веществами являются SDS, DOC (дезоксихолат натрия) и SLS (лаурилсаркозин натрия). Обычными амфотерными поверхностно-активными веществами являются CHAPS (3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат) и CHAPSO (3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -2-гидрокси-1-пропансульфонат). Обычными неионогенными поверхностно-активными веществами являются Тритон Х-100, Тритон Х-114, Твин-20 и NP40.

Примечание: В WB критически важно, чтобы количество отрицательно заряженных молекул SDS, которые связываются с белком, было пропорционально массе белка, чтобы на скорость миграции влияла только масса. Добавление катионных поверхностно-активных веществ в буфер для лизиса нарушит взаимодействие SDS-белок и заставит белки мигрировать в противоположном направлении.

Из-за сложности биохимии белка сложно предсказать оптимальное поверхностно-активное вещество для экстракции данного белка. Таким образом, при возникновении проблем рекомендуется поэкспериментировать с различными поверхностно-активными веществами. Это особенно рекомендуется для мембранных белков.

Связанный: Предварительно окрашенные протеиновые лестницы
Протеиновая лестница (доступен бесплатный образец) Протеиновая лестница широкого диапазона
Каталожный № : PL00001 Каталожный № : PL00002
Охват молекулярной массы: 10-180 кДа Охват молекулярной массы: 3-245 кДа
Количество маркеров: 10 предварительно окрашенных белков. Количество маркеров: 13 предварительно окрашенных белков.
Разрешение предварительно окрашенной белковой лестницы в 10-20% трис-глициновом геле (SDS-PAGE). Разрешение предварительно окрашенной белковой лестницы в 4-12% бис-трис-геле (SDS-PAGE)
4. Ингибиторы протеазы.

Ткани и клетки часто содержат большое количество протеаз. Во время лизиса они высвобождаются и, в свою очередь, могут переваривать целевой белок. Следовательно, ингибиторы протеаз имеют решающее значение для сохранения целевого белка. Обычными ингибиторами протеаз являются PMSF (фенилметилсульфонилфторид), апротинин, лейпептин, пепстатин и AEBSF-HCL (4-бензолсульфонилфторид гидрохлорид). PMSF очень эффективен и является наиболее популярным препаратом для приготовления лизата.

Для функционирования многих ингибиторов протеаз требуется ион двухвалентного металла, поэтому для подавления активности протеазы также часто используется изолирующий агент, такой как EDTA. Кроме того, для фосфорилированных белков-мишеней необходим ингибитор фосфатазы, такой как фторид натрия или ортованадат натрия, для сохранения фосфорилированной формы белка. В частности, очень эффективен ортованадат натрия, но его необходимо активировать, доведя pH раствора до 10, а затем кипятя его до тех пор, пока раствор не станет бесцветным. Другие ингибиторы фосфатазы включают пирофосфат натрия и β-глицеринфосфат.

5. Восстановитель

Многие белки существуют в мультимерах через дисульфидные связи. Восстановители разрушают эти связи, так что экстрагированные белки присутствуют в мономерной форме. Обычными восстановителями являются DTT (дитиотреитол) и BME (бета-меркаптоэтанол). Принимая во внимание все это, буфер RIPA является лучшим выбором для подготовки образца лизата. Мы проверили более 13000 антител в WB, и снова и снова получаем лучшие результаты с использованием буфера RIPA. За прошедшие годы мы усовершенствовали буфер, и ниже вы найдете оптимизированную версию Proteintech:

Буфер RIPA Для 1000 мл
50 мМ Трис HCl, pH 7,4 50 мл
150 мМ NaCl 8,76 мл
1% Triton X-100 или NP-40 10 мл
0,5% дезоксилхолат натрия 5 г
0,1% SDS 1 г
1 мМ ЭДТА (0,5 М запас) 2 мл
10 мМ Наф 0,42 г
Добавить ddH2 O до 1000 мл
Непосредственно перед использованием добавьте PMSF до конечной концентрации 1 мМ и любые другие ингибиторы протеазы.
4 x SDS буфер для образцов Для 1000 мл
12% SDS 120 г
25% глицерин 250 мл
150 мМ Трис.HCl (1М исходный раствор, pH 7,0) 150 мл
0,03% бромфенолового синего 300 мг
20% β-меркаптоэтанол 200 мл
Добавить ddH2От 0 до 50 мл, аликвотировать и хранить при -20 ° C
20% β-меркаптоэтанол (или замененный 500 мМ DTT) перед использованием следует добавить свежим.

Если у вас возникли проблемы с экстракцией обычного лизатного белка, мы рекомендуем читать литературу, а не пробовать наугад различные наборы для экстракции.

Связано: Загрузка контрольных антител

GAPDH обычно используется в качестве контроля загрузки белка при вестерн-блоттинге из-за его стабильно высокой экспрессии в большинстве типов клеток. Этот фермент участвует в нескольких клеточных процессах, таких как гликолиз, репарация ДНК и апоптоз.

Моноклональные антитела Proteintech к GAPDH созданы против цельнобелкового антигена человеческого происхождения и имеют более 2670 цитирований.

Бета-актин обычно используется в качестве контроля нагрузки из-за его широкой и последовательной экспрессии во всех типах эукариотических клеток и того факта, что на уровни экспрессии этого белка не влияет большинство экспериментальных методов лечения.

66009-1-Ig был процитирован более чем в 1135 публикациях и имеет широкую видовую реактивность.

Контрольные антитела Proteintech стоят всего 99 долларов США (150 евро в Европе) за флакон размером 150 мкл.


Выводы

Нацеливание на вновь синтезированные белки MCF, очевидно, является вопросом последовательных шагов: первое решение уже принято в связывании с отдельными белками-шаперонами. Если недавно синтезированный белок связывается с Pex19p, он может быть нацелен на пероксисомы, как продемонстрировал Ant1p. Связанные с Hsp70 препротеины, лишенные высокоаффинного сайта взаимодействия Pex19p, могут вступать в контакт с митохондриальным Tom70 и связываться в сайте, помеченном цистеином C141. Однако их дальнейшая судьба в основном определяется взаимодействиями с Tom40, который служит как общей порой импорта, так и общим фильтром селективности: белки MCF, обнажающие положительно заряженную матричную петлю, а также препротеины, содержащие положительно заряженную предследовательность, будут распознаваться Том40 и вставляем в импортную пору. Связанные с Tom70 белки, содержащие отрицательно заряженную петлю, такие как Ugo1, могут вытесняться из канала импорта Tom40 и вставляться в липидную фазу внешней мембраны митохондрий, другие белки могут высвобождаться и оставаться в цитозоле. Дальнейшие исследования по отбору и транслокации белков-носителей должны быть облегчены новыми данными о структурах с высоким разрешением импортируемого аппарата, которые недавно стали доступными, и идентификацией двудольной целевой последовательности MCF.


Что такое переход от эпителия к мезенхиме (ЭМП)?

Эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) - это процесс, при котором эпителиальные клетки трансформируются в мезенхимальные клетки. Эпителиальные клетки образуют ткань эпителия, которая покрывает внутреннюю и внешнюю поверхность тела организма. Эти клетки поляризованы и образуют обширные межклеточные адгезии, включая слипчивые соединения и плотные соединения, друг с другом [1] [2]. Одна из основных функций эпителиальной ткани - действовать как защитный барьер для подлежащих тканей и органов. Мезенхимные клетки, однако, плохо организованы в трехмерный внеклеточный матрикс [3]. Во время развития мезенхимальные клетки могут приобретать способность мигрировать и дифференцироваться в другие типы клеток. Это приводит к формированию определенных структур, таких как нервный гребень [3].

Во время EMT эпителиальные клетки теряют свою полярность, а также свои межклеточные адгезии и приобретают способность мигрировать, пролиферировать, дифференцироваться и развиваться в определенные ткани и органы. EMT подразделяется на 3 основных типа:

  • EMT типа 1 связан с развитием, таким как формирование эмбриона и развитие органов
  • EMT 2 типа связан с процессами восстановления, такими как заживление ран, регенерация тканей и фиброз органов.
  • ЭМП 3-го типа ассоциируется с метастазированием опухоли [3] [4].

Здесь мы будем рассматривать только EMT в развитии, где он играет важную роль в производстве различных тканей и органов и определении их расположения в организме.

Жесткий матрикс способствует кластеризации интегрина, который способствует привлечению Rac1b к мембране, облегчая его взаимодействие с НАДФН-оксидазой и последующее производство ROC, которые способствуют экспрессии Snail и, следовательно, EMT. С другой стороны, Rac1b с меньшей вероятностью рекрутируется на мембрану клеток в более мягком матриксе.В этой ситуации вероятность возникновения ЕМТ меньше.

Важно отметить, что ЭМП обратима, что означает, что может произойти переход от мезенхимы к эпителию (MET). Фактически, требуется несколько циклов EMT и MET, прежде чем будет установлена ​​окончательная архитектура органа. Эти раунды EMT известны как первичная, вторичная и третичная EMT [3]. Пример первичной EMT происходит во время гаструляции, когда эмбриональный эпителий подвергается EMT с образованием мезодермы. У позвоночных гаструляция индуцируется белками суперсемейства трансформирующих факторов роста & beta (TGF & beta), особенно Nodal и Vg1 [5] [6]. Эти белки TGF & beta вместе с передачей сигналов фактора роста фибробластов (FGFs) индуцируют ген Snail [7] [8] [9], который является ключевым фактором транскрипции для EMT [10]. Улитка способствует отрыву эпителиальных клеток от базальной мембраны до их EMT, подавляя экспрессию E-кадгерина [11] и активируя металлопротеиназы [8]. Это расщепляет комплексы клеточной адгезии и разрушает внеклеточный матрикс, соответственно, чтобы способствовать миграции клеток [10]. Nodal и Vg1 также способствуют передаче сигналов Wnt [6] [12], которая взаимодействует с FGF и Snail, чтобы управлять EMT [9].

Физические свойства регулируют ЭМП

Молекулярные механизмы, управляющие ЭМП, сложны и включают гораздо больше биохимических компонентов. Они подробно рассмотрены в [10]. Помимо биохимических сигналов, механические сигналы, такие как жесткость микроокружения клетки, также играют роль в регуляции ЭМП. Ли и др. наблюдали, что эпителиальные клетки молочных желез подвергались EMT при помещении на твердые подложки и обработке матриксной металлопротеиназой-3 (MMP3). Этого не наблюдалось в клетках, выращенных на мягких субстратах [13]. Кроме того, обработка MMP3 заставляла клетки на обоих субстратах увеличивать экспрессию Rac1b. Однако только те клетки на твердом субстрате продуцируют активные формы кислорода (ROS) [13], которые находятся ниже MMP3 и Rac1b [14]. Интересно, что в клетках на твердых субстратах Rac1b рекрутируется на клеточную мембрану посредством кластеризации интегринов. Это позволяет Rac1b собираться с NADPH оксидазой и вносить вклад в продукцию ROS. Таким образом, было определено, что клетки, растущие на жестких субстратах, будут подвергаться EMT после того, как экспрессия Snail увеличивается после стимуляции Rac1b ROS [14]. Было показано, что более жесткие субстраты способствуют кластеризации интегринов [14] и образованию очаговой адгезии [15], и именно этот процесс ведет к рекрутированию Rac1b и его взаимодействию с NADPH оксидазой, которая продуцирует ROS, что, в свою очередь, способствует EMT. Поскольку мягкие субстраты не способствуют кластеризации интегринов, этот каскад событий не происходит, и клетки, растущие на мягких субстратах, не подвергаются EMT.

Помимо жесткости клеточного микроокружения, в инициировании ЭМП участвуют другие механические нагрузки, налагаемые на эпителиальные клетки со стороны соседних с ними клеток. Это было описано Gomez et al. кто использовал методы микротехнологии для создания сливающегося квадратного листа эпителиальных клеток молочной железы. После лечения их с помощью TGF & beta (индуктора ЭМП) команда заметила, что клетки подвергались ЭМП преимущественно в углу и краю квадрата, которые соответствуют областям с более высоким механическим напряжением [16]. Также было обнаружено, что высокие уровни связанных с миокардином факторов транскрипции A (MRTFA) локализуются в ядре клеток, расположенных в областях с более высокой механической нагрузкой [16].

Когда механическое напряжение ниже, MRTFA связывается с мономерами актина и удерживается в цитоплазме [17]. Однако, когда механический стресс увеличивается, напряжение цитоскелета увеличивается, и это активирует путь передачи сигналов Rho-actin, который снижает количество мономерного актина в цитоплазме, заставляя MRTFA перемещаться в ядро ​​[17] [18]. Здесь MRTFA образует комплекс со Smad3, который связывается с промоторной областью гена SNAI2, активируя его транскрипцию и впоследствии растворяя межклеточные контакты [19]. MRTFA является коактиватором сывороточного фактора ответа (SRF), который активирует актиновые белки цитоскелета, что приводит к ремоделированию цитоскелета [19]. Этот двойной путь активируется после ядерной локализации MRTFA и способствует тому, что эпителиальные клетки подвергаются EMT.

Было обнаружено, что прямого приложения биомеханической силы достаточно для индукции ЭМП. Чжоу и др. растягивали кератиноциты человека, применяя к этим клеткам 10% удлинение, и наблюдали, что приложенная сила может напрямую активировать NF- & kappaB, что, в свою очередь, способствует EMT [20] [21] [22]. Сходным образом, приложение сжимающей силы к клеткам HEK-293, как было показано, индуцирует экспрессию регуляторов EMT SNAI2 и ZEB1 вместе с мессенхимальным маркером VIM через путь RhoA / ROCK [23]. Взятые вместе, эти экспериментальные результаты подчеркивают, что в основе EMT лежит сложная сигнальная сеть, которая включает не только биохимические сигналы, но и множество механических сигналов.


Как работает анализ протеина Брэдфорда

Белковый тест Брэдфорда - это проверенный временем колориметрический анализ. Когда реагент Брэдфорда (подкисленный кумасси бриллиантовый синий G-250) связывается с белками, краситель претерпевает изменение цвета в видимом спектре, при этом максимум поглощения перемещается от 470 до 595 нм. Затем оптическую плотность при 595 нм считывают либо на спектрофотометре, либо на считывающем устройстве для микропланшетов, и она прямо пропорциональна количеству связанного белка. Точную концентрацию белка в образце определяют путем интерполяции стандартной кривой, полученной путем измерения оптической плотности серии разведений стандартов белка с известными концентрациями в пределах линейного диапазона отклика анализа белка Брэдфорда. Белки, обычно используемые в качестве стандартов, включают бычий сывороточный альбумин (BSA) и бычий и гамма-глобулин (BGG).

Существует два типа наборов для анализа белка Брэдфорда. Один содержит готовый к использованию реагент и предварительно разведенные стандарты BSA или BGG для простого и быстрого анализа белка по Брэдфорду. Другой набор обеспечивает большую гибкость при использовании 5-кратного концентрированного реагента и лиофилизированного BSA или стандартов бычьего глобулина, что позволяет пользователю готовить реагент и стандарты любой концентрации.


УФ-сшивание и иммунопреципитация (CLIP)

Интерес к взаимодействиям РНК-белок растет, поскольку мы начинаем осознавать роль РНК не только в устоявшихся процессах, таких как транскрипция, сплайсинг и трансляция, но и в более новых областях, таких как интерференция РНК и регуляция генов некодирующим действием. РНК.

CLIP - это метод на основе антител, используемый для изучения взаимодействий РНК-белок, связанных с иммунопреципитацией РНК (RIP), но отличается от RIP использованием УФ-излучения для перекрестного связывания связывающих РНК белков с РНК, с которой они связаны. Эта ковалентная связь необратима, что позволяет выполнять строгие условия очистки. В отличие от RIP, CLIP предоставляет информацию о фактическом сайте связывания белка на РНК.

Существуют различные типы CLIP, CLIP с высокой пропускной способностью секвенирования (HITS-CLIP), CLIP, усиленный фотоактивируемыми рибонуклеозидами (PAR-CLIP) и индивидуальный CLIP (iCLIP)..

Вот краткое изложение протокола iCLIP, адаптированного от Konig и другие. J. Vis. Exp. 2011. «iCLIP-Транскриптомное картирование взаимодействий белок-РНК с разрешением отдельных нуклеотидов».

Дальнейшая адаптация из книги Гупперца и другие. Методы. 2014. «iCLIP: Взаимодействие белок-РНК при разрешении нуклеотидов».

Буфер для лизиса

Ингибиторы протеазы (добавляйте каждый раз в свежем виде)

Промывка с высоким содержанием соли

Низкое разведение РНКазы Высокое разведение РНКазы

1/500 разведения РНКазы I для приготовления библиотеки 1/50 разведения РНКазы I для контроля на антитела

Промывочный буфер PNK mix

4 мкл 5x буфера PNK pH 6,5 [350 мМ Трис-HCl, pH 6,5 50 мМ MgCl 2 5 мМ дитиотреитол]

Смесь для лигирования A Hot PNK mix

4 мкл 4-кратного буфера для лигирования [200 мМ Трис-HCl 40 мМ MgCl 2 4 мМ дитиотреитол]

1,5 мкл преаденилированного линкера L3 [20 мкМ]

PK-буфер PKurea-буфер

Смесь РНК / праймеров RT mix

0,5 мкл праймера Rclip [0,5 пмоль / мкл]

0,25 мкл обратной транскриптазы Superscript III

Смесь для лигирования B Смесь для отжига олигонуклеотидов

0,8 мкл 10x буфера CircLigase II

1 мкл праймерной смеси P5 / P3 solexa

20 мкл фермента Accuprime Supermix 1

1. УФ-сшивание клеток культуры ткани.

1.1. Удалите среду и добавьте ледяной PBS к клеткам (например, используйте клетки, выращенные в 10-сантиметровом планшете для трех экспериментов, и добавьте 6 мл PBS).

1.2. Снимите крышку, поместите на лед и один раз облучите 150 мДж / см 2 при 254 нм с помощью Stratalinker.

Один или несколько отрицательных контролей следует поддерживать на протяжении всего эксперимента. Нокаутные клетки или ткань, а также несшитые клетки являются хорошими отрицательными контролями, в то время как нокаутные клетки не рекомендуются.

Примечание. Для некоторых белков можно использовать необязательную предварительную инкубацию с 4-тиоуридином и сшивание УФ-А. 4-тиоуридин усиливает сшивание некоторых белков. (Для этого необязательного шага следуйте инструкциям ниже).

Необязательно - Мечение тиуридином и сшивание УФ-А (альтернатива шагу 1.2)

• Добавьте 50 мкл 4SU (исходная концентрация: 100 мМ 4SU) на 10-сантиметровую пластину клеток, культивированных в 10 мл DMEM с добавлением FBS и pen strep, чтобы получить конечную концентрацию 4SU 500 мкМ. В качестве альтернативы добавьте 10 мкл 4-тиоуридина (исходная концентрация: 100 мМ), чтобы получить конечную концентрацию 4SU 100 мкМ.

• Инкубируйте клетки с 4-тиоуридином в течение 60 минут при 500 мкМ или 8 часов при 100 мМ. Проверить жизнеспособность клеток.

• Аспирируйте среду и добавьте 6 мл ледяного PBS к клеткам, растущим в 10-сантиметровом планшете (достаточно для трех иммунопреципитаций). Снимите крышку и поставьте на лед.

• Однократное облучение 2 × 400 мДж / см 2 в Stratalinker 2400 с лампами 365 нм или аналогичным прибором.

1.3. Соберите клетки с помощью скребка для клеток и перенесите суспензию клеток в микропробирки (например, по 2 мл в каждую из трех микропробирок).

1.4. осаждать клетки (вращать на максимальной скорости в течение 10 секунд при 4 ° C), затем удалить супернатант.

1.5. Гранулы клеток мгновенно заморозить на сухом льду и хранить при -80 ° C до использования.

Эксперимент может занять до недели. Избегайте многократных циклов замораживания-оттаивания.

1.6 Подготовка бусинок

1.6.1 Добавьте шарики протеина A или протеина G (например, 100 мкл магнитных шариков на эксперимент) в свежую микропробирку и промойте шарики 2 раза буфером для лизиса.

1.6.2 Ресуспендируйте шарики в буфере для лизиса (100 мкл), добавьте антитела (2–10 мкг) и вращайте пробирки при комнатной температуре в течение 30–60 мин.

Возможно, потребуется оптимизировать количество требуемых антител. Образец без антител является хорошим отрицательным контролем.

1.6.3. Промойте бусины 3 раза буфером для лизиса (900 мкл) и оставьте в последней промывке, пока не будете готовы продолжить иммунопреципитацию (шаг 3.1).

Если антитело работает в IP, это хороший признак того, что оно будет работать в CLIP.

2. Лизис клеток и расщепление частичной РНК.

2.1. Ресуспендируйте осадок клеток в буфере для лизиса с ингибиторами протеаз (1 мл) и перенесите в микропробирки на 1,5 мл.

Примечание. Здесь вы можете попробовать дополнительный этап обработки ультразвуком. Обработка ультразвуком срезает ДНК, которая высвобождает белки из хроматина, увеличивая восстановление комплексов белок-РНК.

Необязательно - обработка образцов ультразвуком

Обработайте образец на льду ультразвуком с помощью ультразвукового зонда. Зонд не должен касаться стенок трубки во избежание вспенивания. Дважды обработайте ультразвуковыми импульсами по 10 секунд при пяти децибелах. Очистите зонд ультразвуковой обработкой H 2 O до и после обработки образца.

Используйте Bioruptor plus в течение пяти циклов с чередованием 30 секунд включения / 30 секунд выключения при низкой интенсивности.

2.2. Добавьте низкое разведение РНКазы (10 мкл) и турбо ДНКазу (2 мкл) к клеточному лизату и инкубируйте ровно 3 мин при 37 ° C, встряхивая при 1100 об / мин, затем сразу же перенесите на лед.

2.3. Вращать при 4 ° C при 22000 г в течение 10 мин и осторожно собрать очищенный супернатант (оставить около 50 мкл лизата с осадком).

Каждый сотрудник лаборатории должен использовать свой собственный набор буферов и реагентов, чтобы упростить идентификацию потенциальных источников загрязнения. Идеальные условия для переваривания РНКазы, возможно, необходимо будет оптимизировать для каждой новой партии РНКазы.

3. Иммунопреципитация и дефосфорилирование 3'-концов РНК.

3.1. Удалите буфер для лизиса из шариков (шаг 1.1.3) и добавьте клеточный лизат (с шага 2.3).

3.2. Поверните образцы в течение 2 часов при 4 ° C.

3.3. Удалите супернатант, промойте шарики 2 раза буфером с высоким содержанием соли (900 мкл), а затем 2 раза промывочным буфером (900 мкл). Поворачивайте эти промывки не менее 1 минуты при 4 ° C.

Оптимизация и строгие условия мойки очень важны.

Примечание. В случае, если стандартные условия iCLIP недостаточно жесткие для специфической очистки интересующего белка, вместо протокола, описанного здесь, можно использовать двойную иммунопреципитацию с денатурацией мочевины. Для получения дополнительной информации см. Huppertz et al. Методы. 2014. «iCLIP: Взаимодействие белок-РНК при разрешении нуклеотидов».

3.4. Удалите супернатант, ресуспендируйте шарики в смеси PNK (20 мкл) и инкубируйте 20 мин при 37 ° C в термомиксере.

3.5. Добавьте промывочный буфер (500 мкл), промойте 1x буфером с высоким содержанием соли, а затем 2x промывочным буфером.

4. Связывание линкера с 3'-концами РНК и мечение 5'-концов РНК.

4.1. Тщательно удалите супернатант, ресуспендируйте шарики в смеси для лигирования A (20 мкл) и инкубируйте в течение ночи при 16 ° C в термомиксере.

4.2. Добавьте промывочный буфер (500 мкл), промойте 2 раза буфером с высоким содержанием соли (1 мл), а затем 2 раза промывочным буфером (1 мл). Выполняйте эти промывки с вращением при 4 ° C в течение 5 минут каждое.

4.3. Удалите супернатант, ресуспендируйте шарики в горячей смеси PNK (4 мкл) и инкубируйте в течение 5 минут при 37 ° C.

4.4. Удалите горячую смесь PNK и ресуспендируйте шарики в 1x SDS-PAGE загрузочном буфере (20 мкл).

4.5. Инкубируйте на термомиксере при 70 ° C в течение 10 мин.

4.6. Немедленно поместите на магнит, чтобы осадить пустые шарики и нанести супернатант на гель (см. Шаг 5).

5. Линкер SDS-PAGE и перенос через мембрану

5.1. Загрузите образцы, а также предварительно окрашенный маркер размера белка (5 мкл) на готовый 4–12% гель Бис-Трис и прогоните гель в течение 50 мин при 180 В в рабочем буфере 1x MOPS (в соответствии с инструкциями производителя).

Рекомендуются гели с постоянным pH 7.

5.2. Снимите переднюю часть геля и выбросьте как твердые отходы (содержит свободный радиоактивный АТФ).

5.3. Перенесите комплексы белок-РНК из геля на нитроцеллюлозную мембрану с помощью устройства для влажного переноса (перенос 1 ч при 30 В в зависимости от инструкций производителя).

5.4. После переноса промойте мембрану в буфере PBS, затем заверните ее в пищевую пленку и выставьте ее на пленку при -80 ° C в течение 30 минут, 1 часа, а затем на ночь.

Флуоресцентная наклейка рядом с мембраной позже позволяет совместить пленку и мембрану. Успех эксперимента можно отслеживать с помощью авторадиографа комплекса белок-РНК после переноса через мембрану.


Заключительные слова

В этой и следующей главах (Ферменты, участвующие в репликации ДНК) мы исследуем процесс репликации.

После описания основного механизма репликации ДНК мы обсудим различные методы, которые исследователи использовали для достижения полного понимания репликации.

Действительно, темой этой главы является сочетание генетических и биохимических подходов, которые позволили нам раскрыть механизм и физиология репликации ДНК.


Смотреть видео: POLACY O MASECZKACH (August 2022).