Информация

Понимание функции насыщения в модели Моно-Ваймана-Чейнджукса

Понимание функции насыщения в модели Моно-Ваймана-Чейнджукса



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я читаю «Математическую физиологию», Снейд. Я студент-математик, заинтересованный в изучении этой области, так что простите меня, если моя терминология неверна. В этом примере автор рассматривает белок с двумя сайтами связывания. Нижний индекс $ i $ указывает количество связанных лигандов. Это выражение, называемое функцией насыщения, появляется на странице 18:

$$ Y = frac {r_1 + 2r_2 + t_1 + 2t_2} {2 (r_0 + r_1 + r_2 + t_0 + t_1 + t_2)} $$

Где, $ r_i, t_i $ обозначают концентрации химических веществ $ R_i, T_i $ соответственно.
Это похоже на средневзвешенное значение ферментов, занявших сайты связывания.

Тот факт, что $ t_0, r_0 $ не появляются в числителе, предполагает, что это насыщение сайтов связывания фермента, $ 2 $ перед $ r_2, t_2 $ указывает, что фермент с занятыми обоими сайтами связывания является "дважды сконцентрированным ". Два в знаменателе указывают количество доступных сайтов связывания в ферменте. Возможно, если бы мы рассматривали фермент с тремя сайтами связывания:

$$ Y = frac {r_1 + 2r_2 + 3r_3 + t_1 + 2t_2 + 3t_3} {3 (r_0 + r_1 + r_2 + r_3 + t_0 + t_1 + t_2 + t_3)} $$

Будет ли это описание правильным?


У меня нет доступа к «Математической физиологии» Снейда, но в описании Википедии модели Монода-Ваймана-Ченджукса они называют Y «фракционной занятостью сайта связывания лиганда». В других источниках это называется «дробное насыщение».

Другими словами, это просто часть сайтов связывания, с которыми в настоящее время связаны лиганды. Тогда знаменателем является общее количество сайтов связывания, которое эквивалентно (для единицы объема) общей концентрации белка (то есть сумме каждой формы белка), умноженной на количество сайтов связывания на белок.

В числителе указано количество связанный с лигандом участок связывания. Что эквивалентно (для единицы объема) концентрации каждой формы, умноженной на количество связанных с ней лигандов. Таким образом, формы с нулевым лигандом умножаются на ноль, формы с одним лигандом умножаются на единицу, формы с двумя лигандами умножаются на два и т.д. для каждой белковой молекулы в 2-связанном состоянии с ней связаны две молекулы лиганда.)

Итак, ответ на ваш вопрос в рамке - да: это была бы подходящая форма для кооперативного белка с тремя сайтами связывания.


50 лет аллостерических взаимодействий: перипетии моделей

Идея непрямого или «аллостерического» взаимодействия между топографически различными сайтами и последующая модель Монода-Ваймана-Ченджекса (MWC) 1965 года для опосредующих их конформационных изменений возникла около 50 лет назад. Многие классические регуляторные белки (включая гемоглобин, транскарбамилазу Asp и никотиновый ацетилхолиновый рецептор) следуют центральной парадигме модели MWC, которая была расширена и оспорена в результате новых технологий. Важно отметить, что концепция аллостерического взаимодействия помогла нам понять болезни человека и дизайн лекарств.


Химическое вскрытие модельного эукариота с высоким разрешением позволяет выявить цели, пути и функции генов

Благодаря эволюционному сохранению биологии, экспериментальные знания, полученные в результате генетических исследований на модельных эукариотических организмах, обеспечивают понимание клеточных путей человека и, в конечном итоге, физиологии. Хемогеномное профилирование дрожжей - мощный подход для аннотирования клеточных ответов на небольшие молекулы. Используя оптимизированную платформу, мы обеспечиваем относительную чувствительность коллекций гетерозиготных и гомозиготных делеций почти для 1800 биологически активных соединений. Качество данных позволяет получить уникальное представление о путях, которые чувствительны и устойчивы к данному возмущению, что продемонстрировано как известными, так и новыми соединениями. Мы представляем примеры новых соединений, которые ингибируют терапевтически релевантные синтазу и десатуразу жирных кислот (Fas1p и Ole1p), и демонстрируем, как индивидуальные профили облегчают эксперименты, основанные на гипотезах, для определения механизма действия соединения. Важно отметить, что масштаб и разнообразие тестируемых соединений дает набор данных, в котором количество модулированных путей приближается к насыщению. Этот ресурс можно использовать для картирования новых биологических связей, а также для определения функций неаннотированных генов. Мы подтвердили гипотезы, сгенерированные глобальной двусторонней иерархической кластеризацией профилей для (i) новых соединений со схожим механизмом действия, действующих на микротрубочки или вакуолярные АТФазы, и (ii) неаннотированной ORF, YIL060w, которая играет роль в дыхании. в митохондриях. Наконец, мы идентифицируем и охарактеризуем фоновые мутации в широко используемой коллекции делеций дрожжей, которая должна улучшить интерпретацию прошлых и будущих скринингов во всем сообществе. Этот всеобъемлющий ресурс клеточных ответов позволяет расширить наше понимание биологии эукариотических путей.

Ключевые слова: Хемогеномное профилирование Cmpd FAS HIP HIP Профилирование HOP HOP Механизм действия MoA Идентификация цели Дрожжевое соединение жирнокислотно-синтазы, гаплонедостаточность, профилирование, гомозиготный механизм профилирования.


Характеристика физиологии гемоглобина в терминах p50 а также п

Кривая насыщения гемоглобина (рис.1 а) обычно характеризуется эмпирически с точки зрения парциального давления кислорода, при котором гемоглобин наполовину насыщен, обычно обозначается как p50, и кооперативность кривой насыщения в точке половинного насыщения, обозначенная как п. Давно признано, что кривая насыщения гемоглобина является сигмоидиальной, что отражает кооперативность связывания кислорода (16, 17). Обширные измерения показывают изменение p50 (18, 19) у млекопитающих от 20-40 мм рт. п варьируется в пределах от 2 до 3,5. Таким образом, оба параметра были изменены в процессе эволюции, предположительно под сильным давлением отбора. Например p50 уменьшается с увеличением веса животных (18, 19), что обычно объясняется различными потребностями основного обмена.

Кривая насыщения гемоглобина и модель MWC. (аКривая насыщения кислородом отображает долю гемовых групп, связанных с кислородом, как функцию парциального давления кислорода. Точка полунасыщения, p50, - парциальное давление, при котором занята половина узлов. Кооперативность п определяет степень, в которой изменение парциального давления кислорода влияет на уровень насыщения. Здесь он схематично показан, хотя на самом деле он определяется как наклон на графике Хилла [log (Y/(1 − Y)) от log (pO2)]. (б) Модель MWC. Предполагается, что тетрамер гемоглобина находится в одной из двух симметричных конформаций: состоянии T с низким сродством (K Т) или состояние R с высоким сродством (K р). В каждой конформации есть пять состояний, индексированных числом связанных атомов кислорода (0–4). Константа равновесия между полностью дезоксигенированными состояниями равна L 0 (≫ 1) и между полностью насыщенными кислородом состояниями L 4 (≪ 1). При низком уровне кислорода молекула находится в состоянии T. При высоких уровнях кислорода равновесие смещается в сторону R-состояния, так как связывание кислорода увеличивается. L T0R4 - константа равновесия при стандартных условиях между состояниями T0 и R4. (c) Энергетическая диаграмма для модели MWC. Физический смысл констант равновесия L и сходство K можно понять из этого графика, изображающего уровни энергии при стандартных условиях. Подробное обсуждение см. SI текст . (d) Измеренные кривые насыщения и MWC подходят для нескольких организмов (квадраты) и нескольких физиологических состояний (кружки). Для изображения в пространстве Хилла см. SI Рис. 6.

На кривую насыщения влияют разные физиологические условия. Различные эффекторы, такие как дифосфоглицерат [DPG (19), продуцируемый как побочный продукт метаболизма при высокой потребности в кислороде] и пониженный pH (производимый как побочный продукт анаэробного метаболизма в мышцах), влияют на кривую насыщения. Когда организм переходит от покоя к напряженной деятельности, его возрастающие потребности в кислороде вызывают падение pH в тканях, смещая кривую насыщения вправо (более высокое значение p50) [эффект Бора (20, 21)]. Эти физиологические адаптации (действующие на шкале от минут до часов) можно сравнить с эволюционными приспособлениями (действующими на шкале тысячелетий), реагирующими на изменение высоты, образа жизни, физических нагрузок, размеров тела или изменений в развитии плаценты, влияющих на баланс транспорта кислорода между матерью и плодом.


Графическая абстракция

Особенности

► The пЧАС значения для конформационных переходов требуют эталонного состояния. ► Для конформационных переходов с пЧАС & gt 1, для эквивалентного мономера: пЧАС & lt 1. ► Истинное соотношение олигомера к мономеру пЧАС значения равно количеству мономеров. ► Нормализация растягивает кривую доза-ответ и увеличивает значение пЧАС. ► Концепция эквивалентного мономера была впервые предложена в 1965 году Криком и Вайманом.


Понимание функции насыщения в модели Моно-Ваймана-Чангуа - Биология

В то время как миоглобин, как мономерный кислородсвязывающий белок, предположительно ограничен гиперболическим насыщением, кислород кооперативно связывается с гемоглобином. Это приводит к сигмоидальной форме кривой насыщения кислородом гемоглобина.

Простая и элегантная модель сигмоидальной кривой связывания - это симметрия или Модель Monod-Wyman-Changeux (MWC). В этой модели гемоглобин принимает две функционально разные формы, имеющие разное сродство к кислороду. Это количественное функциональное различие предположительно связано с определенными структурными или конформационными различиями, и взаимопревращение между ними может (по общему принципу) повлечь за собой изменения во вторичной, третичной и четвертичной структуре. В общей модели MWC оговаривается, что конформация с более низким сродством для мультимерного лиганд-связывающего белка (обозначаемая как состояние T) может претерпевать изменение в состояние с более высокой аффинностью (обозначается как состояние R), и наоборот. Другими словами, формы R и T могут быстро достичь равновесия. В этом случае увеличение концентрации лиганда будет приводить равновесие между R и T к состоянию R, связь между связыванием лиганда и равновесием взаимного превращения R и T называется позитивное сотрудничество. Мы называем влияние концентрации лиганда на конформационное равновесие между R и T a гомотропный эффект. Модель может включать другие эффекторные молекулы, которые связываются в сайтах, отличных от сайта связывания лиганда, и тем самым влиять на R- и T-равновесие в любом направлении. Они называются гетеротропные эффекты.

Для гемоглобина молекулярные детали этого переключения между R и T обсуждаются в нашем тексте. Гетеротропный эффект Бора усиливает транспорт кислорода от легких к дышащим тканям, а также транспорт углекислого газа в противоположном направлении. Другой гетеротропный эффектор - это небольшая молекула 2,3-бисфосфоглицерата (BPG), которая связывается с дезоксигемоглобином, сдвигая конформационное равновесие в сторону Т-состояния. БПГ играет важную роль в высотной адаптации. Гемоглобин плода имеет более низкое сродство к BPG, таким образом, гемоглобин плода имеет более высокую долю конформеров состояния R, чем гемоглобин взрослого человека при любом напряжении кислорода и, следовательно, несколько большее сродство к кислороду. Гемоглобин - это модель так называемых аллостерических белков, белков, которые демонстрируют такое кооперативное поведение посредством гомотропных и гетеротропных эффектов. Теоретическими моделями аллостеризма являются вышеупомянутая модель MWC / симметрии. и несимметричный последовательная модель. Вариантные гемоглобины - фактор патологии человека. Мы рассматриваем случай серповидноклеточная анемия.

Гемоглобин и аллостерическое поведение белков

Изучение гемоглобина (Hb) дает некоторые из самых захватывающих проблесков того, как взаимосвязь структура-функция белка объясняет физиологические адаптации. Мы считаем полезным рассмотреть мультимерный лиганд-связывающий белок, такой как Hb, в отличие от мономерного лиганд-связывающего белка (в данном случае миоглобина или «Mb») и разработать базовые модели кооперативности и аллостерической регуляции. После этого мы обратим наше внимание на структурные и химические детали, лежащие в основе способности Hb быть таким эффективным переносчиком кислорода.

Свойства и физиологические роли белков, состоящих из более чем одной субъединицы, могут существенно отличаться от мономерных версий функционально гомологичного белка. (Под субъединицей мы подразумеваем отдельную полипептидную цепь). Речь идет о контрасте между тетрамерным (состоящим из четырех субъединиц) гемоглобином и его мономерным аналогом миоглобином в мышцах.

Связывание нескольких лигандов в нескольких сайтах белка может привести к очень сложному поведению. Аллостерия - это термин, применяемый к явлению, при котором лиганды, связывающиеся на удаленных друг от друга сайтах в структуре белка, функционально взаимодействуют.

Наиболее частым результатом этого функционального взаимодействия между субъединицами является сотрудничество. Например, олигомерная природа гемоглобина (Hb) делает возможными кооперативные эффекты между субъединицами, где связывание лиганда со специфическим сайтом связывания лиганда на одной субъединице влияет на сродство других к тому же лиганду. Это называется гомотропный эффект. В Hb гомотропные взаимодействия между сайтами связывания кислорода обладают тем свойством, что связывание одной молекулы кислорода в одном сайте увеличивает сродство других сайтов к кислороду, то есть связывание лиганда в Hb показывает позитивное сотрудничество. Аллостерические эффекты также могут быть гетеротропный, включая взаимодействия между различными лигандами. Гетеротропные аллостерические эффекты также проявляются в гемоглобине. Лиганды, такие как CO2, H + и 2,3-BPG влияют на сродство сайтов связывания Hb к O2.

Кривые некооперативного и кооперативного связывания

Как мы видели для миоглобин, предсказанное уравнение для дроби у сайтов связывания лиганда, которые заняты в случае независимых сайтов связывания лиганда (например, когда сайты находятся на отдельных молекулах), описывает гиперболическую кривую связывания. То есть когда у график как функция концентрации лиганда, значение у сначала значительно увеличивается при добавлении относительно небольшого количества лиганда, но по мере увеличения концентрации лиганда увеличение у с тем же количеством добавленного лиганда постоянно падает. В итоге асимптотический предел у = 1 приближается. Значение Kd представляет концентрацию лиганда, при которой занята половина доступных сайтов, т.е. у = 0,5. Гиперболическая кривая, описываемая следующим уравнением, представляет случай некооперативного связывания.

На приведенном ниже графике показана кривая кооперативного связывания, и в отличие от кривой некооперативного связывания она имеет сигмоидальную форму. Это то, что наблюдается на кривой связывания кислорода гемоглобина. Гемоглобин демонстрирует положительную кооперативность, поскольку связывание первого лиганда увеличивает сродство к следующему и так далее. Такие сигмоидальные кривые характерны для кооперативных переходов между двумя различными состояниями, которые включают создание (или нарушение) многочисленных слабых (нековалентных) взаимодействий.

Кривая некооперативного связывания предназначена для Kd = 1. Кооперативная кривая рассчитывалась согласно модель симметрии (см. VVP4e, стр.192, также известный как согласованный или MWC модель, последнее название происходит от имен ее создателей, Monod, Wyman и Changeux). Эта модель описана ниже.

MWC или "сконцентрированная" модель кооперативности и аллостерической регуляции

Модель, постулирующая согласованное изменение одной полностью симметричной четвертичной структуры на другую, может в значительной степени объяснить отличительные свойства гемоглобина. Эта элегантная модель, которую мы назовем MWC Модель учитывает гомотропную положительную кооперативность, а также гетеротропные аллостерические эффекты. Модель MWC названа в честь Жака Моно, Джеффриса Ваймана и Пьера Шанжо, которые сформулировали свою модель аллостерии в 1965 году. Жак Моно был одним из великих пионеров молекулярной биологии.

Концепция двух различных симметричных состояний является центральным постулатом модели MWC. Что касается гемоглобина, мы видели структурные доказательства по крайней мере двух различных четвертичных структур, соответствующих дезокси-Hb и окси-Hb, и эти две структуры служат прототипами того, что мы могли бы удобно назвать состояниями T и R, двумя полностью симметричными четвертичными. структуры, с отчетливым сродством к лиганду (или субстрату). Ниже обсуждается использование концепции равновесия для получения уравнения, воспроизводящего положительно-кооперативную кривую связывания лиганда.

На рисунке ниже показана модель MWC для гипотетического тетрамерного лиганд-связывающего белка с лигандом, обозначенным как A. Субъединицы тетрамера представлены в виде квадратов или кружков, которые представляют только два состояния, которые субъединицы могут принять, T (низкое сродство к A - квадраты) и R (высокое сродство, кружки). Каждая молекула белка, будь то T или R, может связывать 0, 1, 2, 3 или 4 лиганда, вызывая все показанные равновесия.

Обратите внимание, что модель полностью симметрична: нет промежуточных состояний (смешение квадратов и кружков). Четвертичное состояние T состоит из четырех субъединиц (показаны квадратами), все с третичной структурой с низким сродством (мы можем обозначить каждый квадрат в группе из четырех как «т”) С каждым сайтом связывания лиганда, имеющим относительно большую Kd ценить. Четвертичное состояние R состоит из четырех субъединиц (показаны кружками), все с высокоаффинной третичной структурой (мы можем обозначить каждый кружок в группе из четырех как «р”) С каждым сайтом связывания лиганда, имеющим относительно меньшую Kd ценить. Длина стрелок, представляющих равновесия связывания вдоль горизонтального направления фигуры, качественно указывает на эту разницу в аффинностях: верхний ряд равновесий связывания в Т-состоянии по сравнению с нижним рядом равновесий в R-состоянии показывает, что лиганд связывается преимущественно с сайтами на Молекула состояния R. Относительные длины стрелок остаются одинаковыми в обоих рядах на всем протяжении. Напротив, вертикальные стрелки, которые представляют собой равновесия между R и T, качественно показывают по их изменяющейся длине, что по мере того, как концентрация лиганда увеличивается и белок становится все более насыщенным лигандом, равновесие R & hArr T все больше благоприятствует состоянию R. Эта модель дает сигмоидальную кривую насыщения (Y vs. [A]).

В этом математическом описании модель использует три параметра: п, который представляет собой количество сайтов связывания лиганда на молекулу (обычно такое же, как количество субъединиц) L, которое определяется как константа равновесия для преобразования состояния R в состояние T и c, соотношение Kd для состояния R Kd для состояния T.

Одна очень приятная особенность модели заключается в том, что в случае гемоглобина (п = 4) - мы можем объяснить гомотропные и гетеротропные эффекты с помощью одного параметра L. В частности, положительная кооперативность объясняется (из-за связи между связыванием и конформационным равновесием) как уменьшение L по мере увеличения концентрации лиганда. Гетеротропные эффекты, такие как связывание BPG и эффект Бора, объясняются увеличением L, вызванным связыванием BPG или H +. На представленном здесь графике, который представляет собой график уравнения для Y данные выше, две кривые показывают эффект изменения L, когда п = 4 и c остается фиксированным на уровне 0,014. Увеличение L благоприятствует состоянию T и сдвигает сигмоидальную кривую вправо.


К кинетическому моделированию метаболических сетей в масштабе генома без ущерба для стехиометрических, термодинамических и физиологических ограничений

Математическое моделирование - важный инструмент для всестороннего понимания клеточного метаболизма и его взаимодействия с окружающей средой и условиями процесса. Последние разработки в области построения и анализа стехиометрических моделей позволили определить пределы стационарного метаболического поведения с помощью анализа баланса потоков. Однако подробная информация о кинетике ферментов и регуляции ферментов необходима для разработки кинетических моделей, которые могут точно фиксировать динамические метаболические реакции. Использование механистической кинетики ферментов является сложной задачей из-за неопределенности кинетических свойств ферментов. Поэтому в большинстве недавних работ для реакций в метаболических сетях рассматривалась только кинетика массового действия. Здесь мы применили концепцию оптимизации и анализа рисков сложных живых существ (ORACLE) и построили крупномасштабную механистическую кинетическую модель оптимально выращенной Escherichia coli. Мы исследовали сложное взаимодействие между стехиометрией, термодинамикой и кинетикой в ​​определении гибкости и возможностей метаболизма. Наши результаты показывают, что насыщение ферментами является необходимым фактором при моделировании метаболических сетей и расширяет возможные диапазоны метаболических потоков и концентраций метаболитов. Наши результаты также предполагают, что ферменты в метаболических сетях эволюционировали, чтобы функционировать в различных состояниях насыщения, чтобы обеспечить большую гибкость и устойчивость клеточного метаболизма.

Ключевые слова: Упругость Массовое действие Устойчивость насыщения Термодинамика.


Вступление

Гемоглобин - это классический модельный аллостерический белок, исследования которого отражают развитие ключевых концепций кооперативности и аллостерии [1–7]. Стационарный сигмоидальный профиль связывания кислорода с гемоглобином лег в основу формулы Хилла «все или ничего», предложенной в 1910 году [8]. Пятнадцать лет спустя Адэр предложил феноменологический ступенчатый механизм связывания для учета насыщения гемоглобина [9]. Основополагающая статья Линуса Полинга, опубликованная десятью годами позже, была первой, в которой было предложено структурное или геометрическое объяснение кооперативного связывания кислорода гемоглобином. Полинг построил большую статистическую сумму, чтобы соответствовать данным Адаира, используя простую последовательную модель с единственной константой связывания кислорода и одним параметром взаимодействия гем-гем [10]. Более поздние попытки рационализировать кооперативное связывание кислорода с гемоглобином основывались на механистических моделях Моно-Вимана-Чанге (MWC) [11–12] и вдохновленных Полингом моделей Кошланда-Немети-Филмера (KNF) [13]. середина 1960-х годов и, соответственно, включающая согласованные и последовательные переходы субъединиц. Впоследствии стало очевидно, что модель MWC (S1 Fig (панель A)) лучше описывает функцию гемоглобина. В частности, было обнаружено, что гемоглобин существует в равновесии между дезокси и окси конформациями, соответствующими структурным коррелятам соответствующих Т а также р четвертичные конформации формулировки MWC [14–16]. Во-вторых, либо конформация, когда изолирована в кристаллической [17–18] или гелевой фазе [19–20], связывает четыре молекулы кислорода независимым (гиперболическим) образом, хотя и с определенным сродством (KТ а также Kр, соответственно). Другие свидетельства, обобщенные в многочисленных обзорах (е.грамм. [6, 21]), показали, что модель MWC адекватно учитывает гомотропные взаимодействия в гемоглобине с участием четырех удаленных O2-участок связывания.

Иная картина, однако, возникает при попытке применить модель MWC для объяснения гетеротропных взаимодействий гемоглобина. Согласно модели MWC, аллостерические лиганды, активирующие или ингибирующие, влияют только на Т к р четвертичное конформационное равновесие белка (L = [Т]/[р]) [11–12]. Действительно, Эдельштейн (1971) указал, что щелочной эффект Бора гемоглобина с связанным с ним феноменом «буферизации кооперативности» (т.е. наблюдение, что изменение pH влияет в первую очередь на сродство к кислороду (п50) без изменения кооперативности (пЧАС) см. S1 Fig (панель B)) можно объяснить протонными изменениями в L [22]. Однако попытки подогнать стационарные кривые насыщения гемоглобина в присутствии его H +, CO2 или фосфорорганические ингибиторы уравнения MWC, предполагая L-только эффекты, стабильно неуспешные. Скорее, успешное сопоставление с такими физиологическими данными было получено только тогда, когда оба L и c (= Kр/KТ) параметры разрешалось изменять [23–27]. Эти стационарные наблюдения потребовали модификаций исходной модели MWC для включения дополнительных четвертичных конформационных состояний для гемоглобина [24, 28] или третичных взаимодействий [29-31]. Гемоглобин больше не считался «чистым» белком MWC (см. Обсуждение). Тем не менее, некоторые моменты, касающиеся процедуры подбора кривой, оставались проблематичными. Во-первых, большие планки погрешностей обычно получали для оцениваемых параметров, особенно для L [23], указывая на то, что данные, даже если они были точными и тщательно отобранными, не ограничивали значения параметров и что другие наборы параметров также могут дать успешную подгонку. Во-вторых, значения, полученные для L а также c параметры набора физиологических данных, связанных с концентрацией, часто коррелируют без интуитивного механистического объяснения [29,31–32]. Наконец, во многих случаях производные L или c значения не могли масштабироваться с концентрацией эффектора, вместо этого казалось, что они искусственно коррелированы (см., например, строгие наборы физиологических данных, представленные и проанализированные на S2 Рис., относящиеся к эффекту Бора гемоглобина в присутствии различных ингибиторов органофосфата [29]). Эти наблюдения натолкнули на предположение, что данные о насыщении гемоглобина могут быть описаны только двумя [31], а позже даже одним [32] параметром MWC. Можно утверждать, что эти моменты внесли свой вклад в общее представление о том, что оценки параметров MWC, в частности L, не всегда надежны и требуют осторожного обращения.

Элегантное метааналитическое исследование функции гемоглобина Майло и другие. [33] рассмотрели этот вопрос строго. Исследование показало, что из-за разной чувствительности L, Kр а также KТ параметры к экспериментальному изменению, значения этих параметров не могут быть однозначно определены с использованием традиционного уравнения MWC (см. рис. 3 в ссылке [33]). Чтобы преодолеть этот недостаток, авторы представили модифицированную форму уравнения MWC, повторно параметризованную на основе Lc 4 и LKр 4 составных параметра. Подгонка стационарных данных о связывании кислорода к модифицированному уравнению дала надежные оценки для LKр 4 и Lc 4 показателя гемоглобина [33]. Учитывая, что эти параметры соответственно относятся к средней точке перехода (п50) и кооперативность (пЧАС) фенотипические параметры кривой связывания [33], использование модифицированной версии уравнения MWC имеет интуитивный смысл. Тем не менее, модифицированное уравнение не может дать оценок элементарного L, Kр а также KТ Параметры MWC гемоглобина.

В L, Kр а также KТ параметры относятся к конкретным, легко интерпретируемым этапам пути лигирования MWC [11]. Более того, знание значений этих параметров важно для понимания того, как физиологические изменения, мутации и эволюционные вариации влияют на функцию гемоглобина. В этой рукописи мы представляем две простые стратегии для получения надежных оценок L, Kр а также KТ как для физиологических, так и для эволюционных вариаций и предлагают критерии для оценки эффективности каждой стратегии. Используя обширные физиологические и эволюционные функциональные наборы данных, доступные для модели аллостерического белка гемоглобина, ранее скомпилированной [33], мы демонстрируем полезность описанных здесь стратегий для получения надежных механистических знаний о гемоглобине. Наши результаты показывают, что как гомотропные, так и гетеротропные взаимодействия адекватно описываются традиционной моделью MWC. Кроме того, настоящее исследование очерчивает общую дорожную карту для успешного согласования данных о стационарном связывании лиганда с аллостерической моделью MWC для получения надежных оценок механистических параметров интересующего белка.


Результаты и обсуждение

Модель связывания лиганда и конформационных изменений.

На рис. 1 показана классическая модель MWC для связывания лиганда (A) с белком, который может существовать либо в R, либо в T состояниях (11). В случае ATCase связывание может происходить либо с c (субстрат), либо с r (эффекторными) сайтами, и шесть субстратов / эффекторов могут связываться с каждой молекулой (т.е. п = 6). Поскольку каждая из шести цепей c (или цепей r) считается эквивалентной в этой модели, все микроскопические константы диссоциации для данного состояния одинаковы (KD, R Микро и KД, Т Micro для состояний R и T соответственно) и KD (T, j) = j/(п & # x02212 j + 1)KД, Т Micro. Связанные связывающие равновесия на рис. 1 образуют термодинамический цикл, так что L & # x02032 = c n L, где L = [Тп]/[рп], L & # x02032 = [Тп& # x000b7Ап]/[рп& # x000b7Ап], а также c = KD (R, j)/KD (T, j) = KD, R Микро /KД, Т Micro. Из-за присущей ей простоты модель MWC использовалась для объяснения связывания лиганда во многих кооперативных системах (11), а в случае ATCase большой объем данных, накопленных за длительный период, поддерживает этот способ связывания (9). В принципе, ЯМР-спектроскопия является чрезвычайно мощным инструментом для дальнейшего тестирования модели и получения окончательных ответов, которые менее очевидны при использовании других методов. Например, с другими биофизическими подходами, которые не исследуют конкретные сайты независимо, а сообщают только средние свойства, локальные эффекты, приписываемые связыванию субстрата / эффектора, не могут быть отделены от сопутствующих глобальных сдвигов в равновесии R & # x02013T. Напротив, ниже мы покажем, что изменения химических сдвигов вблизи сайтов связывания в ответ на связывание лиганда обеспечивают чувствительные репортеры равновесия связывания лиганда с белком, тогда как сопутствующее появление отдельных резонансов, соответствующих как состояниям R, так и T, приводит к окончательным выводам. о влиянии связывания лиганда на равновесие R & # x02013T. Эта способность & # x0201cdissect & # x0201d & # x0201d сложных равновесий, показанных на рис.1, была использована, например, чтобы окончательно установить, что связывание нуклеотидов сдвигает соотношение R & # x02013T, вопрос, который остается спорным (13, 14).

Метил-ТРОЗИЯ ATCase.

На рис. 2 показан спектр 1 H-13 C-метил-TROSY гетероядерной множественной квантовой корреляции (HMQC) U- [2 H] Ile - [& # x003b41 13 CH3] -меченная нелигандированная WT-ATCase, записанная при 800 МГц (частота 1 H) в течение 40 минут на спектрометре, оборудованном головкой зонда при комнатной температуре при 37 ° C (0,1 мМ в комплексе, 0,6 мМ в мономере). Высокое отношение сигнал / шум набора данных и короткое время измерения позволяют предположить, что метильные группы будут ценными зондами молекулярной конформации и динамики в этой системе, что позволит изучить влияние широкого диапазона лигандов в относительно короткие сроки. порядок. Кроме того, поскольку молекулы холофермента могут быть собраны из r- и c-цепей (при желании с разными паттернами ЯМР-мечения) (19), можно легко установить корреляцию с типом цепи и, при необходимости, изучить интактный фермент, который помечен только одна из двух цепей. Как показано на рис. 2, область Ile корреляционной карты 1 H, 13 C ATCase хорошо разрешена, и, подготовив образцы с меткой, ограниченной цепями r или c, можно разделить две или три перекрывающиеся перекрестные цепи. пиков и подсчитать все 27 корреляций, которые происходят от 27 остатков Ile в молекуле. Поскольку в отсутствие лигандов равновесие R & # x02013T сильно смещено в сторону T (9), спектр на фиг. 2, таким образом, соответствует спектру T-состояния. Кроме того, поскольку для каждого Ile наблюдается только одна корреляция, каждая цепь c (r) должна быть структурно идентичной или, в качестве альтернативы, любые различия в структуре между цепями должны быстро усредняться по шкале времени химического сдвига ЯМР (т. Е. Быстрый обмен ). Although it likely is possible that individual peaks could be assigned to specific sites in the protein by using approaches similar to those described in the context of our work on the proteasome (5), we have not done so here. Instead, we show that quantitative inferences about binding and allostery can be made simply by analysis of how spectra change as a function of ligand, without time-consuming steps that are involved in resonance assignment.

Binding of Active Site Ligands and Analogues.

Upon titration of U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3]-labeled WT-ATCase with substrate CbmP or its nonhydrolyzable analogue phosphonoacetamide (PAM), a number of the correlations derived from the c chain shift linearly, consistent with weak binding (millimolar affinity) and exchange rates that are fast on the NMR chemical shift time scale [see below and supporting information (SI) Fig. 6]. In contrast, cross-peaks from residues in the r chain (that are all distant from the binding site) do not shift during the titration. During the course of the titration, a second set of correlations emerges, consistent with a second conformation in slow exchange with the T state. This finding is illustrated in Fig. 3 А, which focuses on an Ile correlation from the r chain with chemical shifts (ω 13 C,ω 1 H) = (9.3 ppm, 0.90 ppm) in the unliganded WT state ( Fig. 3 A Upper, first column) and a second Ile correlation (9.8 ppm, 0.31 ppm) derived from the c chain ( Fig. 3 A Lower). Addition of saturating amounts of CbmP or PAM produces a second set of peaks for both correlations, as indicated in the second and third columns of Fig. 3 А. To establish the identity of this second state, we have recorded spectra of ATCase with different substrates or analogues that are known to shift the equilibrium to R and of a double mutant (cK164E, cE239K) that has been shown to be exclusively in the R form even when unliganded (22). Columns 4 and 5 of Fig. 3 А show how spectra change with saturating amounts of the high-affinity, bisubstrate analogue phosphonoacetyl- l -aspartate (PALA) ([PALA]/[ATCase]мономер = 1.5, where [ATCase]мономер is the concentration of the c chains that form the PALA binding site) and saturating quantities of CbmP and succinate, an analogue of the reactant aspartate ([CbmP]/[ATCase]мономер = 30, [succinate]/[ATCase]мономер = 75), respectively. The corresponding region of the Ile correlation map of unliganded cK164E, cE239K𠄺TCase is shown in column 6. The excellent correspondence between chemical shifts of the second conformer in spectra of CbmP or PAM-loaded WT-ATCase and the correlations in the subspectra of columns 4𠄶 that are known to derive from the R state establishes that the observed second state in CbmP- or PAM-saturated ATCase is indeed the R form of the enzyme. Note that the correspondence in shifts is better for residues in the r chain ( Fig. 3 A Upper) than in the c chain ( Fig. 3 A Lower) because residues proximal to substrate binding sites formed by the c chains sense both the binding event and the T to R conformational transition. Further, the similarity in shifts between spectra of unliganded cK164E, cE239K𠄺TCase and R states of the enzyme generated through the addition of ligands argues strongly that the double mutant form of the enzyme is a good model of the R state (see SI Fig. 7). The titration data also establish unequivocally that both CbmP and PAM shift the equilibrium toward R and thus bind preferentially to this state, in agreement with the MWC model. This finding is in contrast to results from earlier literature in which it was argued that CbmP binding would not shift the equilibrium (23). Finally, the absence of exchange cross-peaks connecting correlations between R and T states in magnetization exchange experiments recorded on a PAM-saturated sample allows an upper limit of 𢒁/s to be placed on the exchange between the two conformers.

Because the exchange between R and T conformers is slow on the NMR chemical-shift time scale (i.e., separate correlations are observed for each state), it is possible to measure the R–T equilibrium under saturating conditions of PAM or CbmP (see below), where correlations derived from both states are visible. In the absence of chemical-shift assignments of correlations in R and T states, care must be taken to ensure that equilibrium constants are derived from intensities of cross-peaks that belong to the same residue. Two residues have been identified for which the R–T pairs can be assigned with certainty, corresponding to the correlations illustrated in Fig. 3 А (SI Fig. 8), and values of L′ can be estimated from them. Differential relaxation of magnetization from R and T states during the course of the NMR experiment that could perturb the relative intensities of correlations, and hence L′ values, also must be accounted for, as described in Материалы и методы. A value of L′ = 3.4 ± 1.2 has been calculated with PAM saturation, corresponding to ΔграммT−R = 𢄠.76 ± 0.22 kcal/mol. Because of the lability of CbmP, only an approximate value of L′ = 1.5 (ΔграммT−R ∼ 𢄠.24 kcal/mol) could be obtained for this compound. Values of L′ for CbmP and PAM are in reasonable agreement with the previously reported value of 7 for CbmP, considering that different pH values were used in the two sets of measurements (1 pH unit different) (10), the known sensitivity of ATCase function to pH (24), the different solvents used (H2O versus D2O), and the fact that ATCase used in the present set of experiments is highly deuterated.

Measuring the R–T Equilibrium Constant.

The ability to monitor R and T conformations independently provides NMR with a unique advantage over many other spectroscopic techniques. It can be shown that if ligand binding is in the fast exchange limit and separate signals are observed from the R and T states (i.e., slow exchange), then chemical shift changes of cross-peaks belonging to either R or T states that accompany ligand binding can be described by a simple hyperbolic isotherm with the extracted dissociation constant KD, R Micro or KD, T Micro (see SI текст). In contrast, titration curves derived from techniques that monitor contributions from both R and T states simultaneously must be analyzed by taking the complete reaction scheme into account ( Fig. 1 ), and the resulting binding curves will be sigmoidal. Рис. 3 B shows the titration of a correlation from WT-ATCase (Левый) as a function of added PAM along with the corresponding titration for the same residue from cK164E, cE239K𠄺TCase (Верно). All titration curves that derive from binding to either T (WT-ATCase) or R (cK164E, cE239K𠄺TCase Fig. 3 C) states of the enzyme were fit simultaneously to a simple PAп + А модель. Excellent fits were obtained with this hyperbolic binding model, as expected. Ценности KD, T Micro = 3.8 ± 0.3 mM and KD, R Micro = 1.8 ± 0.1 mM were extracted from fits of 8 and 10 titration curves, respectively, and by using these KD Micro values along with L′ = 3.4 ± 1.2 and the relation L′ = c 6 L (see above), a value of 300 ± 190 is calculated for L = [T6]/[R6] ( Fig. 1 ), corresponding to ΔграммT−R = 𢄣.5 ± 0.4 kcal/mol, which agrees well with a previously published value of L = 250 based on analytical ultracentrifugation (10) and less well with L = 70 obtained from SAXS (25). Thus, even though correlations from the R state cannot be observed in spectra of unliganded WT-ATCase, the relative populations of R and T still can be established, albeit indirectly, by using the linked binding equilibria of Fig. 1 and data obtained from titration of R and T states with ligand.

Effects of Ligand Binding to the Regulatory Chains.

The presence of significant populations of both R and T conformers in the PAM-saturated enzyme ( Fig. 3 А) allows a straightforward determination of how effectors such as ATP and CTP perturb the R–T equilibrium. Рис. 4 А shows examples of how the R–T equilibrium is shifted upon addition of MgATP (Центр) or MgCTP (Верно) starting from PAM-loaded WT-ATCase (Левый). Although it is difficult to quantify precisely the shift upon addition of ATP, because the population of the T state becomes very low, changes in L′ of 15- to 30-fold are estimated from spectra, leading to a decrease in L′ from 3.4 ± 1.2 to 0.1𠄰.2. Conversely, the effect with CTP is opposite, with correlations from the R conformer disappearing completely from spectra. Such changes are in complete agreement with the MWC model of heterotropic effects, where binding of ATP to the R state is favored and binding of CTP to the T state is preferred.

The spectra of Fig. 4 А, which were obtained with saturating amounts of PAM, could also be explained, however, under the assumption that MgATP binding does not affect the R–T equilibrium directly but rather promotes conformational changes in at least one of the states. These changes would lead to an increase in R state affinity for substrate Asp (12) or for its analogue succinate and by extension also for the CbmP analogue, PAM, and subsequent shifting of the R–T equilibrium only on substrate binding. The latter explanation was put forth to explain the results of SAXS experiments (13, 26). In particular, if this model were operative, we would expect to see significant changes in chemical shifts of probes in the c chain upon ATP binding that reflect the “postulated” changes in structure leading to higher affinity of substrate, which, however, is not what we observed. Of the 22 cross-peaks in 1 H, 13 C correlation spectra of U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3] PAM-saturated WT-ATCase that are well resolved (belonging to either of T or R conformers), only 2 change position by at least 0.1 ppm in 1 H or 0.4 ppm in 13 C when MgATP is added. These two peaks, both from the regulatory chain, are almost certainly rIle12 and rIle86, which contact bound ATP directly (8). The other 20 peaks change positions by π.025 ppm and 0.2 ppm in 1 H and 13 C, respectively peaks obscured by overlap move very little as well. The fact that a set of 20 well dispersed peaks that includes probes in the c chain change position very little in response to the addition of MgATP suggests that even if binding of nucleotide does induce alteration of R and T conformations, these changes must be minor, at least in parts of the molecule remote from the site of nucleotide binding. A similar situation also holds for MgCTP. Results from a second experiment are even more conclusive in favor of the MWC model. From the measured value L = 300 for WT-ATCase and the fact that MgATP shifts the equilibrium to the R state by 15- to 30-fold (see above), L′ is predicted to be in the range of 10� in the presence of saturating amounts of ATP. Thus, the ATP-saturated R form of the enzyme is expected to constitute 𢒅�% of the population (effective monomer concentration of 50� μM), and with the sensitivity of the NMR methodology used here, such a fraction should be observable, even for a system as large as ATCase. As predicted by our numerical estimates and the MWC model, Fig. 4 B shows that the addition of saturating amounts of MgATP to unliganded WT-ATCase does indeed produce measurable amounts of R, estimated to be on the order of 5% on the basis of relative peak heights. Note that in the second set of spectra ( Fig. 4 B Lower), addition of ATP also causes a shift in one of the correlations from the T state (cross-peak tentatively assigned to rIle12), as indicated by the arrow. The only explanation for the appearance of R state cross-peaks is that MgATP is an allosteric effector that directly alters the R–T equilibrium.

To study the binding of MgATP to ATCase in more detail, we have recorded an ATP titration series. Unfortunately, the two significantly perturbed Ile correlations in 1 H- 13 C spectra, most likely derived from rIle12 and rIle86 as discussed above, are not particularly useful for quantifying binding because rIle12 titrates into another peak and rIle86 broadens very significantly in response to ATP addition (because of the large 1 H chemical-shift difference between free and bound forms, 0.64 ppm). To increase the number of probes available, a U-[ 2 H] Ile-[㭁 13 CH3],Leu,Val-[ 13 CH3, 12 CD3]-labeled WT-ATCase sample was prepared so that cross-peak positions from Leu and Val residues could be quantified as well. Labeling in the complex was confined to only the r chain, the site of ATP binding. The HMQC correlation map of this Ile-, Leu-, and Val-labeled ATCase sample is provided in SI Fig. 9 there are a total of 27 Leu and Val residues in the r chain, and 50 peaks can be counted in the Leu-Val region of the spectrum. Of interest, one of the Val residues, rVal121, is immediately adjacent to the fully protonated catalytic chain, and its signal would not be expected to be observed because of contributions to transverse relaxation resulting from proximal 1 H spins (27) such a situation also occurs for rIle115, which is proximal to the c chain.

Upon titration of MgATP into the Ile, Leu, and Val methyl-labeled sample of WT-ATCase, the majority of peaks shift in position, although no more than 36 Hz in either 1 H or 13 C dimensions, with little or no broadening, consistent with fast exchange. A pair of correlations that are assigned tentatively to Leu and Val residues from the amino-terminal end of the r chain that are proximal to the nucleotide binding site shift in position by at least 0.35 ppm in the 1 H dimension and broaden beyond detection during the course of the titration. Of note, the trajectories of at least six of the correlations that titrate in the fast exchange limit are not linear, indicating that the binding of MgATP to ATCase is more complex than 1:1, as observed previously (28, 29). To quantify the binding further, we chose 17 titration curves (either 1 H or 13 C) derived from 13 peaks that were in the fast exchange limit and fitted these data simultaneously to a number of binding models. Several of the titration profiles are shown in Fig. 5 А, а Вставка highlighting the response to binding for low [MgATP] makes it clear that the binding cannot be described by a hyperbolic function, which would characterize a 1:1 interaction. Global fits to such a model produced a poor reduced χ 2 value (𢒅) with noticeable deviations from experiment for low [MgATP]. The data subsequently were fit to a sequential binding model (SI Fig. 10) that assumes a pair of equivalent binding sites where the binding of ligand to the first site alters the affinity at the second (cooperative binding). Although outside the scope of the MWC model, which postulates that the intrinsic affinity of ligand at one site is independent of the binding of ligand to a second site (i.e., same microscopic binding), the sequential model is attractive on the basis of the structure of ATCase in which the regulatory chains that bind nucleotides are arranged as dimers that certainly could 𠇌ommunicate” in response to ligand binding (8).

Рис. 5 B shows a χ 2 surface of the distribution of K1 а также K2 values that are obtained from the fits of the titration curves, where K1 а также K2 are the macroscopic dissociation constants associated with the first and second binding events, respectively. The bold line, 4K1 = K2, indicates where microscopic dissociation constants for the first and second binding events are the same so that no binding cooperativity is observed. Points above the line correspond to positive cooperativity of binding (i.e., binding at the first site increases affinity at the second), whereas those below the line indicate negative cooperativity. The seven best solutions obtained from a grid search of (K1, K2) space are indicated by circles in the plot with the best solution corresponding to K1 = 7.9 mM and K2 = 0.25 mM. These solutions lie within a shallow trough on the χ 2 surface, where K1& # x000d7 K2 ∼ 2 mM 2 . Finally, the bold contour line encompasses the range of solutions that lie within the 95% confidence limit (for a model with 221 degrees of freedom). It is worth noting that an alternative model that assumes consecutive binding to two noninteracting sites with different affinities can be rejected via F test statistical criteria. Other studies involving NaATP binding in which data have been interpreted in terms of a consecutive binding model report K1 а также K2 values of 0.065 and 1.25 mM, respectively, at 4ଌ and K1 = 0.14 mM and K2 = 0.67 mM at 24ଌ, pH 7 (28, 29). Deviations from the values obtained here likely arise from the different experimental conditions used because, for example, it is known that increasing temperature decreases nucleotide affinity (28).

In summary, we have presented an NMR study of how ligand binding affects the allosteric equilibrium in the 306-kDa enzyme ATCase. Despite the size of this system, high-sensitivity 1 H, 13 C correlation maps of Ile, Leu, and Val methyl groups could be obtained in very reasonable measuring times (ρ h) using protein concentrations ρ mM in monomer (𼅠 μM in complex), so that large numbers of spectra could be recorded as a function of different ligands or ligand concentrations. By using relations that describe linked binding equilibria, a value for L = [T6]/[R6] could be calculated for WT ATCase, despite the fact that the R form of the protein is “invisible.” The effect of binding of a variety of different substrates or substrate analogues and nucleotides on the R–T equilibrium could be well understood within the framework of the MWC model, and the binding of MgATP to ATCase was shown unequivocally to alter this equilibrium, in contrast to observations from a series of other studies (12, 13, 25, 26). This work emphasizes the important role that modern solution NMR spectroscopy can play in providing quantitative information on systems with molecular masses in the hundreds of kilodaltons.


Информация об авторе

Принадлежности

Guangdong Provincial Education Department Key Laboratory of Nano-Immunoregulation Tumour Microenvironment, The Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, Guangzhou, Guangdong, PR China

Centre for BioNano Interactions, School of Chemistry, University College Dublin, Dublin, Ireland

Kenneth A. Dawson & Yan Yan

School of Biomolecular and Biomedical Science, UCD Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research, University College Dublin, Dublin, Ireland


Смотреть видео: Breathing Exercise: Watch what happens to my Oxygen levels when I do THIS.. (August 2022).