Информация

Электронная транспортная система - биология

Электронная транспортная система - биология



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Митохондрии

Митохондрии имеют две мембраны, внутреннюю мембрану и внешнюю мембрану. Внутренняя мембрана намного больше внешней, но связана с внутренними складками, называемыми кристами. Между внутренней и внешней мембранами есть межмембранное пространство, а пространство внутри внутренней мембраны называется матрицей, которая содержит ферменты и другие реагенты. Внешняя мембрана проницаема для других молекул, поскольку содержит митохондриальный порин, который является порообразующим белком. Внутренняя мембрана имеет непроницаемую мембрану для большинства ионов и полярных молекул и проницаема только для АТФ, пирувата и цитрата из-за переносчиков метаболитов.

Электронная транспортная система

Как показано на этой диаграмме, потоку электронов от NADH к O2 способствуют несколько промежуточных переносчиков электронов, например электроны перемещаются от восстановленного донора, такого как малат, к окисленному донору, такому как OAA. Электроны движутся от носителя к носителю вниз по благоприятному градиенту энергии к конечному акцептору электронов O2. Благоприятный градиент энергии обусловлен тем, что электроны движутся к компонентам с более положительным восстановительным потенциалом и, следовательно, более высоким сродством к кислороду. Когда происходит поток электронов, протоны проходят через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство.

Компоненты электронной транспортной цепи

Когда электроны текут вниз по градиенту энергии от НАДН к О2, четыре белковых комплекса, которые катализируют окислительно-восстановительную реакцию, являются:

  • Комплекс I = комплекс НАДН-Q редуктазы
  • Комплекс III = комплекс цитохром с редуктазы
  • Cyt C = цитохром c
  • Комплекс IV = комплекс цитохром с оксидазы

Когда электроны текут вниз по градиенту энергии от FADH2 к O2, четыре белковых комплекса, которые катализируют окислительно-восстановительную реакцию, являются:

  • Комплекс II = сукцинатдегидрогеназа
  • Комплекс III = комплекс цитохром с редуктазы
  • Cyt C = цитохром c
  • Комплекс IV = комплекс цитохром с оксидазы

Примечание: электроны из FADH2 входят в цепь переноса электронов в четвертом белковом комплексе, сукцинат-Q редуктазе. Этот белковый комплекс содержит сукцинатдегидрогеназу, которая отвечает за образование FADH2 в результате реакции превращения сукцината в фумарат. Поскольку электроны FADH2 входят в цепь переноса электронов на более поздних этапах цикла, они перекачивают меньше ионов H + в межмембранное пространство (белковый комплекс II не перекачивает ионы H +), что означает, что вырабатывается меньше АТФ.

Коэнзим Q:

Почему электроны текут в этом направлении?

Мы определяем поток электронов, вычисляя энергетические зависимости от электронного сродства и окислительно-восстановительного напряжения.

Изменение в Eо’ : «Стандартный» потенциал восстановления @ 1 M восстановленная форма (донор), 1 M окисленная форма (акцептор), 25 градусов C, pH 7 (Подобно тому, как потенциал переноса фосфорила измеряется ΔG, потенциал переноса электрона измеряется ΔEо)

Измерение окислительно-восстановительного потенциала: Мы можем измерить ΔEо’Относительно 1M H+/ насыщенный H2 газ Мы можем измерить потенциал электронного переноса электрона, поставив следующий эксперимент. Есть два электрических терминала, один из которых содержит раствор ячейки для образца, содержащий 1M восстановленную форму (1M NADH) и 1M окисленную форму (1M NAD+), а другой содержит стандартную эталонную ячейку, 1M H+ и 1M насыщенный H2 газ. Электроды в двух растворах соединены вольтметром. Вольтметр измеряет напряжение между двумя выводами. Электроны текут из одной ячейки в другую. Если электроны текут из ячейки для образца в стандартную ячейку сравнения и имеют отрицательное напряжение, у нас будет электрод в растворе, подключенный к другому электроду в стандартной ячейке сравнения. Измеряя напряжение между клеммами,.

Взаимосвязь между стандартной дельтой G изменения свободной энергии и стандартной дельтой E потенциала снижения:

Стандартные восстановительные потенциалы для некоторых реакций:

Объедините реакции и стандартные восстановительные потенциалы: Измените полуреакцию донора и умножьте его восстановительный потенциал на -1; сложите потенциалы реакций и восстановления

Объедините реакции и стандартные восстановительные потенциалы: Измените полуреакцию донора и умножьте его восстановительный потенциал на -1; сложите потенциалы реакций и восстановления

В этой реакции выделяется значительное количество энергии за счет восстановления O2 с НАДН. Свободная энергия, высвобождаемая в этой реакции, генерирует протонный градиент, который управляет синтезом АТФ и транспортом других метаболитов.


ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ, ЭЛЕКТРОННАЯ ТРАНСПОРТНАЯ ЦЕПЬ

Окислительное фосфорилирование включает сочетание окисления NADH или FADH2 дыхательной цепью с синтезом АТФ через градиент протонов через внутреннюю мембрану митохондрий.

ЭЛЕКТРОННАЯ ТРАНСПОРТНАЯ ЦЕПЬ

Цепь переноса электронов состоит из правильно организованного и ориентированного набора переносчиков электронов, транспортирующих электроны в определенной последовательности от восстановленного никотинамидного кофермента (НАДН) или восстановленной простетической группы флавина (FADH2) к молекулярному O2.

Внутренняя митохондриальная мембрана несет цепь переноса электронов, называемую дыхательной цепью митохондрий, которая формирует последний путь для потока электронов от тканевых субстратов к молекулярному O2.

На каждом этапе электроны текут от реактива окислительно-восстановительной пары, имеющего более низкий окислительно-восстановительный потенциал, к окислителю другой окислительно-восстановительной пары, обладающей более высоким окислительно-восстановительным потенциалом.

Свободная энергия, высвобождаемая при прохождении электронов по цепи, используется для образования высокоэнергетических связей АТФ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Последовательность реакций, посредством которых восстановленные формы коферментов повторно окисляются молекулярным O2, известным как цепь переноса электронов.

Цепочка имеет основные электронные носители.

  • НАДН-дегидрогеназа.
  • Сукцинатдегидрогеназа.
  • Коэнзим Q.
  • Цитохромы b2, bH, b560, c1, c, a, & amp a3 и белки серы железа.

Каждый из них функционирует как окислительно-восстановительная система с его простетической группой или ионами металлов, которые попеременно меняются на восстановитель и окислитель - формы во время переноса электронов.

ЭТАПЫ РЕАКЦИИ

Для управления цепью переноса электронов во внутренней мембране митохондрий по отдельности представлены четыре комплекса.

Комплекс I или НАДН-CoQ редуктаза

Он переносит восстанавливающие эквиваленты (то есть H + и e) от NADH к CoQ через его FMN и железо-серные кластеры, окисляя NADH и восстанавливая CoQ.

Комплекс II или сукцинат-CoQ редуктаза

Он переносит кластеры непосредственно в CoQ из сукцината через его FAD, цитохром v560 и железо-серные кластеры.

Комплекс III или QH2 цитохром C редуктаза

  • Комплекс III переносит электроны от QH2 на цитохром C.
  • QH2 передает один из двух своих электронов Fe2S2.
  • Второй электрон последовательно переносится цитохромом b2, pH цитохрома и снова CoQ.
  • Позже менее принятый электрон переходит непосредственно к цитохрому С1.
  • Затем цитохром C1 отдает электрон цитохрому C

Комплекс IV или цитохром С оксидаза

  • Он передает по одному электрону от каждого из четырех последовательных.
  • Молекулы ферроцитохрома С превращаются в молекулы O2, образуя четыре молекулы феррицитохрома С и две молекулы воды.

/>

Вам также может понравиться

БИОТЕХНОЛОГИИ

ФЕРМЕНТЫ


Синопсис

Привлекательность аноксигенных несодержащих серы фотосинтезирующих бактерий (Rhodospirillaceae) для изучения регуляции генов в ответ на клеточные окислительно-восстановительные процессы основана на их энергетической гибкости, которая позволяет расти в различных условиях окружающей среды. В присутствии кислорода электроны переносятся по дыхательной цепи, содержащей НАДН (или ФАДН), убихинон (Q), цитохром. до н.э1, цитохром c2 и, наконец, к кислороду цитохромоксидазами или убихинолоксидазами, тем самым обеспечивая фосфорилирование АДФ через комплексы АТФазы. Обратите внимание на функциональную гомологию с дыхательной цепью митохондрий. При низком давлении кислорода индуцируется биосинтез внутрицитоплазматических мембран (ICM). Специфические компоненты полипептид-бактериохлорофилл (BChl) этих мембран - фотосинтетические светособирающие комплексы (LHC) и реакционные центры (RC) - захватывают световую энергию, которая управляет системой циклического фотофосфорилирования через RC-Q-cyt до н.э1-cyt c2 обратно в RC. Еще в 1957 году было заявлено, что окислительно-восстановительное состояние компонентов дыхательной и фотосинтетической цепи переноса электронов (ETC) может представлять собой метаболические сигналы, которые регулируют экспрессию генов, кодирующих LHC и RC, и, следовательно, определяют адаптацию клеток к данное состояние окружающей среды (Коэн-Базир и другие, 1957). Подавление синтеза ICM при высоком давлении кислорода, а также анаэробно при высокой интенсивности света было подробно изучено в течение последних лет, и были идентифицированы некоторые вовлеченные регуляторные системы, в том числе двухкомпонентная система RegA / RegB (PrrA / PrrB), PpsR (CrtJ) репрессор и Fnr-подобный регулятор транскрипции FnrL (Oh and Kaplan, 2000 Bauer и другие, 2003). Однако, особенно для световой регуляции синтеза ICM, молекулярные сигналы и механизмы, участвующие в инициации путей передачи сигналов, управляющих экспрессией фотосинтетических генов, все еще плохо охарактеризованы или даже не определены. Эффект репрессии при высоком освещении был объяснен зависимостью от окислительно-восстановительного состояния мембранного пула Q (Oh and Kaplan, 2000). Однако, насколько нам известно, прямых экспериментальных измерений окислительно-восстановительных состояний Q при различных условиях освещения пока нет. Недавно было продемонстрировано, что окисленный Q напрямую ингибирует регуляторную систему RegB / RegA Rhodobacter capsulatus in vitro (Свем и другие, 2006), тем самым потенциально опосредуя подавление синтеза ICM также в условиях высокого содержания кислорода в темноте.

Отсутствие количественной информации о том, как окислительно-восстановительные состояния отдельных компонентов ETC изменяются при различных условиях роста, ограничивает проверку предложенных гипотез окислительно-восстановительной регуляции, а чисто качественное обсуждение поведения ETC невозможно, поскольку задействовано слишком много переменных. Здесь мы представляем (i) стехиометрическую модель ETC, однозначно описывающую структурные и функциональные возможности ETC пурпурных несерных бактерий, и (ii) кинетическую модель, основанную на термодинамических ограничениях основных процессов, которая позволяет нам моделировать установившееся поведение ETC, в частности окислительно-восстановительные состояния компонентов ETC, в различных условиях окружающей среды.

Элементарный анализ (см. Schuster и другие, 2000) ETC показывает девять основных режимов, выражающих все потенциальные функциональные поведения ETC в устойчивом состоянии. Стехиометрическая модель воспроизводит хорошо известные циклы и пути ETC при работе в условиях фотосинтеза (циклический фотосинтез и обратный транспорт электронов), респираторного (перенос электронов от НАДН или сукцината к убихинолоксидазе или цитохрому (cbb3) оксидаза) или в ферментативных (восстановление фумарата) условиях. Помимо этих хорошо известных функций, стехиометрическая модель выявила два рабочих режима, представляющих обратный поток электронов в условиях дыхания. До сих пор функциональная роль обратного потока электронов обсуждалась в основном только для фотосинтетического роста. Фактически, из-за термодинамических ограничений, обратный поток электронов в аэробных условиях играет лишь второстепенную роль, и, как показывают симуляции кинетической модели, отношения концентраций задействованных метаболитов должны быть на довольно экстремальных уровнях, чтобы сделать это состояние термодинамически благоприятным. . Однако эта операция может стать важной для определенных (возможно, временных) метаболических состояний, например, если возникает большой дисбаланс в текущих окислительно-восстановительных потенциалах НАДН и сукцината.

Таким образом, стехиометрическая модель идентифицировала - непредвзято - значимые функции ETC, однако, она может показать только потенциальные поведения ETC (которые в реальных условиях обычно накладываются друг на друга). Поэтому для изучения реальных движущих сил, электронных потоков и окислительно-восстановительных состояний, происходящих в ETC в различных условиях окружающей среды, мы создали кинетическую модель, которая также включает известные регуляторные пути, управляющие экспрессией компонентов ETC. Хотя в фотосинтезирующих бактериях присутствуют два типа мембран, преобразующих энергию (ICM и цитоплазматическая мембрана), которые структурно и функционально различны, мы создали модель только с одним мембранным отсеком. Мы оправдываем этот подход, потому что мы рассматриваем в симуляциях только сценарии, в которых модель функционирует либо как чистая фотосинтетическая мембрана (модель ICM) (т.е. без участия оксидаз), либо как чистая респираторная (цитоплазматическая) мембрана (без участия фотосинтетических РЦ). Стадии реакции, происходящие внутри ферментных комплексов, были описаны с помощью довольно простых, но термодинамически правильных кинетических законов, основанных на различиях в окислительно-восстановительных потенциалах участвующих окислительно-восстановительных пар. В качестве граничных условий для метаболитов, непосредственно взаимодействующих с ETC, мы фиксируем отношения концентраций НАДН / НАД, сукцинат / фумарат и АТФ / АДФ (которые, однако, могут варьироваться для различных рассматриваемых сценариев).

Насколько нам известно, это наиболее полная модель ETC у пурпурных бактерий в отношении рассматриваемых компонентов и процессов. Несмотря на то, что мы не можем утверждать, что модель является точной, когда рассматриваются абсолютные количественные единицы (неопределенности в параметрах и только несколько доступных измерений не позволяют этого), она дает ценную полуколичественную и качественную информацию о поведении ETC, в частности, о окислительно-восстановительном потенциале. состояния ключевых компонентов, которые часто трудно измерить.

Важные результаты стационарного анализа модели показаны на рисунке 5. Графики показывают зависимость окислительно-восстановительных состояний Q и цитохрома. c2 бассейны (Q_charge а также c2_charge), протонодвижущей силы (pmf) и концентрации БХл (Bchl как показатель ICM) на цитозольном окислительно-восстановительном состоянии (представленном NADH / NAD) для четырех различных условий роста: аэробных и полуаэробных в темноте и анаэробных в условиях высокой и низкой освещенности. Модель способна воспроизводить наблюдения об уровнях ICM, которые подавляются во время аэробного роста и освобождаются от подавления кислородом в полуаэробных условиях. Важно отметить, что уровень ICM соответствует степени снижения Q. То, что условия ограничения кислорода приводят к более уменьшенному пулу Q по сравнению с полностью аэробным ростом, можно прямо вывести из работы линейной дыхательной цепи. Напротив, адаптация окислительно-восстановительного состояния Q, когда система циклического фотофосфорилирования сталкивается с различными интенсивностями света, не может быть выведена просто на основе чистой интуиции. Насколько нам известно, вопрос о том, приводит ли переход от условий высокой освещенности к низкой освещенности к более уменьшенному (как требует физиологическая регуляторная модель для объяснения репрессии синтеза ICM при высоком освещении) или к более окисленному пулу Q, в настоящее время не решается с помощью литературные данные. Поразительно, но моделирование этой ситуации с помощью математической модели дает однозначный результат: пул Q уменьшается больше в условиях низкой освещенности, что соответствует его предполагаемой роли в качестве метаболического сигнала для экспрессии ICM (Swem и другие, 2006). Важно отметить, что этот результат практически не зависит от используемых значений параметров, а является неотъемлемой особенностью системы. Мы не смогли найти набор параметров, в котором получается противоположный результат, то есть Q уменьшается больше в условиях высокой освещенности.

Другой вывод, который можно сделать из рисунка 5, заключается в том, что (только) в условиях фотосинтеза существует оптимальная нагрузка на ETC электронами (и, следовательно, оптимальное окислительно-восстановительное состояние цитозоля здесь отражается соотношением NADH / NAD), что приводит к максимуму Δп. Модель наглядно демонстрирует, что оптимальная нагрузка зависит от интенсивности света. Такое двухфазное поведение невозможно увидеть для респираторного роста: Δп монотонно увеличивается с увеличением окислительно-восстановительного состояния цитозоля.

Эти результаты иллюстрируют ценность и применимость модели, представленной для получения прогнозов поведения ETC в аноксигенных фотосинтезирующих бактериях, которые в настоящее время ожидают экспериментальной проверки.


Электронно-транспортная система или окислительное фосфорилирование в растениях

Окислительное фосфорилирование концептуально просто и механически сложно. По световой реакции фотосинтеза видно, что хлорофилл, возбужденный поглощением фотонных частиц солнечного света, отдает электрон с высокой энергией, и, наконец, через серию электронных камер одна за другой он возвращается к хлорофиллу, теряя энергию. Эти электронные носители вместе называют системой транспорта электронов. Это кульминация серии энергетических преобразований, которые называются клеточным дыханием или просто дыханием в целом. Окислительное фосфорилирование - это процесс, при котором перенос электронов от предшественников энергии из цикла лимонной кислоты приводит к фосфорилированию АДФ с образованием АТФ. Это также происходит в митохондриях.

Позиция: Эти носители упорядоченно расположены на мембране тилакоидов хлоропласта. К перевозчикам относятся:


Фотосинтез

Легкая сборка

Первый шаг в фотосинтезе - поглощение света пигментами. Помимо различных типов хлорофилла, эти пигменты включают каротиноиды и тетрапирролбилиновые пигменты с открытой цепью, обнаруженные, например, в цианобактериях. Хлорофилл - это пигмент на основе тетрапиррольного кольца, похожий на гемоглобин, за исключением того, что он содержит магний, а не железо. Кольцо связано с длинной боковой цепью. Хлорофилл поглощает синий и красный свет, а пропускает зеленый и, следовательно, выглядит зеленым. В растениях два типа хлорофилла, а а также б, увеличьте диапазон поглощаемых длин волн. Световая энергия, поглощаемая молекулами хлорофилла, может либо теряться в виде тепла или флуоресценции, либо передаваться между соседними молекулами хлорофилла посредством резонансной передачи. Хлорофилл и каротиноиды связываются с белками в светособирающих комплексах. Светособирающие комплексы имеют форму пончика в бактериях, вероятно, окружающих реакционный центр. Светособирающий комплекс действует как антенна, похожая на спутниковую тарелку, подает фотоны в реакционные центры, содержащие димерную форму хлорофилла, где происходит разделение зарядов. Идея антенны возникла после открытия в 1932 году Эмерсоном и Арнольдом, что только один CO2 Молекула образовалась из ~ 2500 молекул хлорофилла после короткой вспышки света.

На более высоком уровне организации лист и его клетки также приспособлены к эффективному улавливанию света. В тени фотосинтетический аппарат расположен на больших тонких листьях, чтобы увеличить площадь захвата света и позволить свету адекватно проникать, и на одну антенну приходится больше собирающего свет хлорофилла. Внутри листа эпидермальные клетки могут фокусировать свет, удлиненные палисадные клетки действуют как световоды, в то время как клетки мезофилла отражают свет, действуя как «зеркальный зал» и увеличивая расстояние, на которое проходят фотоны, тем самым увеличивая вероятность их попадания. антенный комплекс.


Полученные результаты

Ротенон и TTFA вызывают гибель трансформированных и раковых клеток.

Линия клеток эмбриональной почки человека HEK 293 и линия клеток глиомы U87 инкубировали с ингибитором mETC-complex-I ротеноном (50 мкМ) или ингибитором mETC-complex-II TTFA (0,5 мМ) в течение 0, 24, 48 и 72 часов, и гибель клеток измеряли по проницаемости мембраны. Гибель клеток вызывалась ротеноном и TTFA в течение 72 часов в клетках HEK 293 и U87 (фиг. 1). В клетках HEK 293 ротенон и TTFA вызывали 30% и 40% гибели клеток, соответственно, через 72 часа (рис. 1A), тогда как в клетках U87 они вызывали гибель клеток на 40% и 90% соответственно (рис. 1B). . Ротенон и TTFA также вызывали дозозависимую гибель клеток в клетках HEK 293 и U87 (данные не показаны).

Ротенон и TTFA вызывают гибель клеток в клетках HEK 293 и U87 в течение 72 часов. Смерть клеток определяли количественно, как указано в разделе «Материалы и методы». Клетки HEK 293 (A) и U87 (B) обрабатывали 50,0 мкМ ротенона (ингибитор комплекса R-I) или 0,5 мМ TTFA (ингибитор комплекса T-II) в течение 72 часов. Планки погрешностей представляют собой s.e. из трех независимых экспериментов.

Ротенон и TTFA вызывают гибель клеток в клетках HEK 293 и U87 в течение 72 часов. Смерть клеток определялась количественно, как указано в разделе «Материалы и методы». Клетки HEK 293 (A) и U87 (B) обрабатывали 50,0 мкМ ротенона (ингибитор комплекса R-I) или 0,5 мМ TTFA (ингибитор комплекса T-II) в течение 72 часов. Планки погрешностей представляют собой s.e. из трех независимых экспериментов.

Ротенон и TTFA вызывают аутофагию в трансформированных и раковых клетках.

Аутофагия характеризуется образованием кислых везикулярных органелл (AVO) (аутофагосомы и аутолизосомы), и во время аутофагии экспрессируются белки аутофагии, такие как беклин 1 и ATG5, а легкая цепь 3 (LC3, MAP1LC3), связанная с микротрубочками, располагается на аутофагосомы (Baehrecke, 2005 Codogno and Meijer, 2005 Gozuacik and Kimchi, 2004 Guimarães and Linder, 2004 Levine and Yuan, 2005 Mariño and López-Otín, 2004). В этом исследовании обнаружение аутофагии осуществлялось путем измерения: (1) образования AVO с помощью проточной цитометрии (FACS) (2) электронной микроскопии (EM) AVO (3) образования вакуолей, меченных GFP-LC3 (из AVO) с помощью трансфекции и флуоресцентной микроскопии и (4) превращения цитоплазматической формы LC3 (LC3-I, 18 кДа) в преаутофагосомную и аутофагосомную мембраносвязанную форму LC3 (LC3-II, 16 кДа) с помощью вестерн-блоттинга, и экспрессия беклина 1 методом вестерн-блоттинга. Ингибитор комплекса-I ротенон и ингибитор комплекса-II TTFA значительно индуцировали образование AVO в клетках HEK 293 и U87 в течение 72-часового периода времени (фиг. 2Ai-ii, дополнительный материал, фиг. S1). Образование AVO, индуцированное ротеноном и TTFA в клетках HEK 293 и U87, подавлялось ингибитором аутофагии 3-метиладенином (3-MA) ​​примерно на 40% и 50%, соответственно, после обработки клеток в течение 48 часов (рис. 2Aiii). В качестве положительного контроля клетки НЕК 293 помещали в условия голодания для увеличения образования AVO, это увеличение блокировалось 3-МА (дополнительный материал, фиг. S2A). С помощью электронной микроскопии мы идентифицировали двухмембранные аутофагосомы (рис. 2B, черные стрелки), содержащие цитозольное содержимое в клетках HEK 293 после обработки TTFA в течение 48 часов, напротив, ядра (N) были четко видны в необработанных клетках (рис. 2B). ). Поскольку LC3 является специфическим маркером образования аутофагосом (Mizushima, 2004), GFP-LC3 кДНК трансфицировали в клетки, и клетки с вакуолями, меченными GFP-LC3, подсчитывали с помощью флуоресцентного микроскопа в течение 48 часов. В соответствии с результатами образования AVO, ротенон и TTFA индуцировали значительное образование GFP-LC3-меченых вакуолей (25-30%) в клетках HEK 293 и U87 после 48 часов обработки, тогда как 6 часов обработки показали небольшое GFP-LC3. меченые вакуоли (рис. 2Ci, ii). На фиг. 2Ciii показано образование меченных GFP-LC3 вакуолей после обработки клеток U87 ротеноном в течение 48 часов. Образование этих вакуолей ингибировалось обработкой 3-МА. Образование вакуолей, меченных GFP-LC3, также ингибировалось 3-MA после обработки TTFA в клетках U87 и после обработки ротеноном или TTFA в клетках HEK 293 (фиг. 2Civ). В качестве положительного контроля клетки НЕК 293 помещали в условия голодания для увеличения количества вакуолей, меченных GFP-LC3, это увеличение блокировалось 3-МА (дополнительный материал, фиг. S2B). В качестве отрицательного контроля клетки трансфицировали одним GFP или обрабатывали ДМСО, как ожидалось, после обработки ротеноном или TTFA не наблюдалось образования вакуолей (данные не показаны).

Ротенон и TTFA вызывают аутофагию. Клетки HEK 293 и U87 обрабатывали, как описано на фиг. 1. (A) Процент клеток с AVO (аутофагосомы и автолизосомы) определяли с помощью проточной цитометрии. Скорости образования AVO, индуцированного ротеноном (R) и TTFA (T), указаны в (i) клетках HEK 293 и (ii) U87 в течение 72-часового периода времени. (iii) Эффект 3-МА (2,0 мМ) на образование AVO, которые были индуцированы ротеноном или TTFA после 48-часовой обработки в клетках U87 и HEK 293. п значения менее 0,05 представляют значительную разницу между условиями, как указано. (B) Снимки под электронной микроскопией были сделаны для клеток HEK 293, которые не были обработаны (контроль) или обработаны TTFA (0,5 мМ) в течение 48 часов. Стрелки представляют собой двухмембранные вакуоли в клетках, обработанных TTFA (увеличенное изображение). N представляет собой ядро. (C) Формирование вакуолей, меченных GFP-LC3 (точки). Определяли процент клеток с GFP-LC3-мечеными вакуолями (точки) в (i) клетках HEK 293 и (ii) клетках U87 после обработки ротеноном или TFFA в течение 48-часового периода. Планки погрешностей представляют собой s.e. трех независимых экспериментов. (iii) Репрезентативные изображения трех независимых экспериментов с клетками U87, обработанными одним GFP, только GFP-LC3, GFP-LC3 и ротеноном, и GFP-LC3, ротеноном и 3-MA (2,0 мМ), были получены с помощью микроскопа Olympus и охлаждающей камеры. Ядрышко окрашивали DAPI (синий). (iv) Клетки HEK 293 и U87 обрабатывали ротеноном или TTFA в присутствии или в отсутствие 3-MA (2,0 мМ). (D) Превращение LC3-I в LC3-II определяли в (i) HEK 293 и (ii) клетках U87, обработанных ротеноном или TTFA в течение 6, 16 или 24 часов в присутствии или в отсутствие лизосомального ингибитора NH.4Cl (30 мМ). Клетки лизировали и проводили вестерн-блоттинг на экспрессию LC3. Блоты удаляли и повторно зондировали антителом против актина для равной нагрузки. (E) Экспрессия Beclin 1 определялась после обработки ротеноном и TTFA в клетках HEK 293 и U87 после 48 часов обработки. Клетки лизировали и проводили вестерн-блоттинг для определения беклина 1 и актина в качестве контроля загрузки.

Ротенон и TTFA вызывают аутофагию. Клетки HEK 293 и U87 обрабатывали, как описано на фиг. 1. (A) Процент клеток с AVO (аутофагосомы и автолизосомы) определяли с помощью проточной цитометрии. Скорости образования AVO, индуцированного ротеноном (R) и TTFA (T), указаны в (i) клетках HEK 293 и (ii) U87 в течение 72-часового периода времени. (iii) Эффект 3-МА (2,0 мМ) на образование AVO, которые были индуцированы ротеноном или TTFA после 48-часовой обработки в клетках U87 и HEK 293. п значения менее 0,05 представляют значительную разницу между условиями, как указано. (B) Снимки под электронной микроскопией были сделаны для клеток HEK 293, которые не были обработаны (контроль) или обработаны TTFA (0,5 мМ) в течение 48 часов. Стрелки представляют собой двухмембранные вакуоли в клетках, обработанных TTFA (увеличенное изображение). N представляет собой ядро. (C) Формирование вакуолей, меченных GFP-LC3 (точки). Определяли процент клеток с GFP-LC3-меченными вакуолями (точки) в (i) клетках HEK 293 и (ii) U87 после обработки ротеноном или TFFA в течение 48-часового периода. Планки погрешностей представляют собой s.e. трех независимых экспериментов. (iii) Репрезентативные изображения трех независимых экспериментов с клетками U87, обработанными одним GFP, только GFP-LC3, GFP-LC3 и ротеноном, и GFP-LC3, ротеноном и 3-MA (2,0 мМ), были получены с помощью микроскопа Olympus и охлаждающей камеры. Ядрышко окрашивали DAPI (синий). (iv) Клетки HEK 293 и U87 обрабатывали ротеноном или TTFA в присутствии или в отсутствие 3-MA (2,0 мМ). (D) Превращение LC3-I в LC3-II определяли в (i) HEK 293 и (ii) клетках U87, обработанных ротеноном или TTFA в течение 6, 16 или 24 часов в присутствии или в отсутствие лизосомального ингибитора NH.4Cl (30 мМ). Клетки лизировали и проводили вестерн-блоттинг на экспрессию LC3. Блоты удаляли и повторно зондировали антителом против актина для равной нагрузки. (E) Экспрессия Beclin 1 определялась после обработки ротеноном и TTFA в клетках HEK 293 и U87 после 48 часов обработки. Клетки лизировали и проводили вестерн-блоттинг для определения беклина 1 и актина в качестве контроля загрузки.

Превращение LC3-I в LC3-II является еще одним специфическим маркером аутофагии. В клетках HEK 293 и U87 и ротенон, и TTFA индуцировали гораздо большее количество экспрессии LC3-II по сравнению с контролем после 16 и 24 часов обработки, тогда как экспрессия LC3-II не увеличивалась после 6 часов обработки (рис. 2D). . В присутствии лизосомального ингибитора хлорида аммония (NH4Cl), который предотвращает деградацию LC3 в аутофагосомах, количество LC3-II увеличивалось после обработки ротеноном или TTFA как в клетках HEK 293, так и в клетках U87 (фиг. 2D). Однако NH4Обработка Cl не приводила к значительному увеличению образования вакуолей, меченных GFP-LC3, после обработки ротеноном или TTFA (данные не показаны). Подобно накоплению LC3-II, экспрессия беклина 1 также значительно увеличивалась ротеноном и TTFA в клетках HEK 293 и U87 после 6 часов обработки (фиг. 2E). Вместе ротенон и TTFA могут вызывать аутофагию в трансформированных и раковых клетках.

Ротенон и TTFA вызывают гибель аутофагических клеток в трансформированных и раковых клетках.

Аутофагию часто рассматривают как механизм выживания, вызванный голоданием, и ее роль как механизма гибели клеток является спорной (Mariño and López-Otín, 2004). Мы определили, способствует ли аутофагия, индуцированная ротеноном или TTFA, гибели клеток. Гибель клеток, индуцированная ротеноном или TTFA как в клетках HEK 293, так и в клетках U87, ингибировалась 3-MA на 40%, тогда как ингибитор каспаз zVAD-fmk (zVAD) не подавлял индуцированную ротеноном и TTFA гибель клеток в клетках HEK 293 ( Рис. 3A). Более того, один zVAD не смог вызвать аутофагию в клетках HEK 293 и U87. В клетках U87 zVAD способен снижать гибель клеток, индуцированную ротеноном и TTFA, что позволяет предположить, что в клетках U87 происходят как аутофагия, так и апоптоз (рис. 3A). Чтобы подтвердить эти результаты, мы определили степень фрагментации ДНК (признак апоптоза) с помощью пика суб-G1 и анализа TUNEL. Клетки HEK 293, обработанные ротеноном или TTFA, не индуцировали апоптоз, тогда как этопозид (агент, повреждающий ДНК) индуцировал апоптоз в клетках HEK 293 (фиг. 3B). В клетках U87 и ротенон, и TTFA индуцировали апоптоз, но в меньшей степени, чем лечение этопозидом (рис. 3B). Степень апоптоза в клетках HEK 293 или U87 после обработки ротеноном или TTFA не изменилась в присутствии 3-MA (дополнительный материал, рис. S3). Поскольку экспрессия белков беклина 1 и ATG5 способствует индукции аутофагии, мы снизили их экспрессию путем трансфекции миРНК против беклина 1 и ATG5 в клетки U87 (фиг. 3Ci) и клетки HEK 293 (дополнительный материал, фиг. S4). Были определены эффекты лечения ротеноном и TTFA на аутофагию, гибель клеток и апоптоз. Трансфекция беклина 1 и ATG5 siRNAs в клетках снижали индуцированное ротеноном и TTFA образование AVO и образование GFP-LC3-меченой вакуоли (рис. 3Cii, iii), а также подавляли уровень гибели клеток, индуцированный ротеноном и TTFA (рис. 3Di). На апоптоз, индуцированный ротеноном и TTFA (образование пиков суб-G1), не влияли беклин 1 и ATG5 миРНК (рис. 3Dii). Similar results were found for HEK 293 cells (supplementary material Fig. S4). These results indicate that autophagy induced by rotenone and TTFA contributes to cell death.

ROS are a mediator for autophagic cell death induced by rotenone and TTFA

Because ROS have been implicated in autophagy (Xu et al., 2006 Yu et al., 2006) and apoptosis (Pelicano et al., 2004), we determined whether ROS mediate autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA. Both rotenone and TTFA induced elevated ROS generation in a 72-hour time course in HEK 293 and U87 cells (Fig. 4A, supplementary material Fig. S5). ROS generation was detected following 1 hour of treatment and remained elevated throughout the 72-hour time course. Presence of the ROS scavenger tiron (1.0 mM) reduced ROS generation following rotenone and TTFA treatment in both HEK 293 and U87 cells (Fig. 4Bi). A reduction in AVO formation and in the formation of GFP-LC3-labeled vacuoles was also detected in these tiron-treated cells (Fig. 4Bii,iii). Similar results were found with the ROS scavengers glutathione and L-cysteine (supplementary material Fig. S6A-C). Expression of beclin 1 and conversion of LC3-I to LC3-II induced by rotenone and TTFA were significantly reduced by the presence of tiron (Fig. 4C). Total cell death was also reduced by tiron in HEK 293 and U87 cells (Fig. 4Di). Similar findings were found with other ROS scavengers in HEK 293 cells (supplementary material Fig. S6D). By contrast, tiron failed to affect apoptosis (formation of sub-G1 peaks) following rotenone or TTFA treatment in HEK 293 and U87 cells (Fig. 4Dii). This indicates that ROS scavengers decreased autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA in transformed and cancer cells.

Manganese-superoxide dismutase (SOD2) is one of the mitochondrial antioxidant enzymes that reduce superoxide levels within cells (Pelicano et al., 2004). The effects of rotenone and TTFA on ROS generation, autophagy, cell death and apoptosis were investigated in wild-type and SOD2-overexpressing HeLa cells (western blot of SOD2, see supplementary material Fig. S7). After a treatment of 24 hours, rotenone and TTFA induced 40% and 60% ROS generation, respectively, in the wild-type cells these figures were reduced to 14% and 24%, respectively, in the SOD2-overexpressing cells (Fig. 5A). Importantly, the overexpression of SOD2 in HeLa cells also reduced rotenone- or TTFA-induced autophagy. Rotenone and TTFA induced 20% and 30% formation of AVOs, respectively, in HeLa cells, and this was reduced to 6% and 4%, respectively, in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5Bi). In agreement with the results of AVO formation, rotenone and TTFA induced the formation of GFP-LC3-labeled vacuoles in wild-type cells but not in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5Bii, supplementary material Fig. S8). Again, compared with controls, rotenone and TTFA significantly induced beclin 1 expression and conversion of LC3-I to LC3-II in wild-type cells, whereas these processes were blocked in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5C). Treatment with NH4Cl increased LC3-II expression in wild-type cells following rotenone or TTFA treatment but failed to increase LC3-II expression in SOD2-overexpressing cells (Fig. 5Cii). Overexpression of SOD2 also decreased the levels of cell death induced by rotenone and TTFA by 34% and 45%, respectively (Fig. 5D). The autophagy inhibitor 3-MA inhibited rotenone- and TTFA-induced cell death by 30% and 34%, respectively, in the wild-type cells, but it had no effect on the rotenone- and TTFA-induced cell death when SOD2 was overexpressed (Fig. 5D). As a control, 3-MA was able to reduce the formation of GFP-LC3-labeled vacuoles induced by rotenone and TTFA in these cells (supplementary material Fig. S8). When zVAD was added, cell death was reduced in wild-type cells and in SOD2-overexpressing cells, and, when 3-MA and zVAD were combined, cell death was further reduced in wild-type cells. This indicates that both autophagy and apoptosis that occur in wild-type cells contribute to overall cell death induced by rotenone or TTFA, whereas only apoptosis was induced in SOD2-overexpressing cells. To confirm that apoptosis is occurring, wild-type and SOD2-overexpressing cells were treated with rotenone or TTFA and sub-G1 peak analysis or TUNEL assay was preformed. Rotenone and TTFA induced apoptosis both in wild-type and SOD2-overexpressing cells (Fig. 5E). As a positive control, HeLa cells were treated with etoposide, which induced apoptosis to a greater extent than rotenone or TTFA (Fig. 5E). Etoposide induced total cell death to a similar extent as rotenone in wild-type cells (data not shown). Taken together, these results indicate that the rotenone and TTFA-induced cell death in SOD2-overexpressing cells might be mainly apoptotic because it was not inhibited by 3-MA (Fig. 5D). This is in agreement with the fact that rotenone and TTFA did not induce autophagy when SOD2 was overexpressed (Fig. 5B,C).

Rotenone and TTFA induce autophagic cell death in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R) 0.5 mM TTFA (T) 3-MA, 2.0 mM (autophagy inhibitor) and/or zVAD, 0.1 mM (caspase inhibitor). (A) Effect of autophagy and apoptosis inhibitors on rotenone- or TTFA-induced cell death after treatment for 48 hours was determined. HEK 293 or U87 cells were treated with TTFA or rotenone alone or with each in combination with 3-MA, zVAD or both. Etoposide (100 μM) was used as an apoptotic stimuli. The amount of cell death was determined by membrane permeabilization, as described in the Materials and Methods section. (B) The amount of apoptotic cell death was determined by sub-G1 peak or TUNEL analysis. HEK 293 or U87 cells were treated with rotenone, TTFA or etoposide and the percentage of apoptotic cells was determined. (C) Effect of siRNAs against the autophagic genes beclin 1 and ATG5 on rotenone- or TTFA-induced autophagy, cell death and apoptosis in U87 cells after a treatment of 48 hours was determined. U87 cells were not transfected (non siRNA) or were transfected with scrambled siRNA or siRNAs against beclin 1 or ATG5. (i) Cells were lysed and western blotted for beclin 1 and ATG5. Blots were stripped and re-probed with anti-actin antibody for equal loading. (Cii,Ciii,Di,Dii) The effects of siRNA against beclin 1 and ATG5, and of scrambled siRNA, on AVO formation (Cii), GFP-LC3-labeled vacuoles (Ciii), cell death (Di) and apoptosis (formation of sub-G1 peaks) (Dii) following rotenone or TTFA treatment were determined. Error bars represent s.e. from three independent experiments. * Represents significant difference from control conditions (п& lt0.05). # (A) Represents a lack of significant difference from control conditions (п>0.05).

Rotenone and TTFA induce autophagic cell death in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R) 0.5 mM TTFA (T) 3-MA, 2.0 mM (autophagy inhibitor) and/or zVAD, 0.1 mM (caspase inhibitor). (A) Effect of autophagy and apoptosis inhibitors on rotenone- or TTFA-induced cell death after treatment for 48 hours was determined. HEK 293 or U87 cells were treated with TTFA or rotenone alone or with each in combination with 3-MA, zVAD or both. Etoposide (100 μM) was used as an apoptotic stimuli. The amount of cell death was determined by membrane permeabilization, as described in the Materials and Methods section. (B) The amount of apoptotic cell death was determined by sub-G1 peak or TUNEL analysis. HEK 293 or U87 cells were treated with rotenone, TTFA or etoposide and the percentage of apoptotic cells was determined. (C) Effect of siRNAs against the autophagic genes beclin 1 and ATG5 on rotenone- or TTFA-induced autophagy, cell death and apoptosis in U87 cells after a treatment of 48 hours was determined. U87 cells were not transfected (non siRNA) or were transfected with scrambled siRNA or siRNAs against beclin 1 or ATG5. (i) Cells were lysed and western blotted for beclin 1 and ATG5. Blots were stripped and re-probed with anti-actin antibody for equal loading. (Cii,Ciii,Di,Dii) The effects of siRNA against beclin 1 and ATG5, and of scrambled siRNA, on AVO formation (Cii), GFP-LC3-labeled vacuoles (Ciii), cell death (Di) and apoptosis (formation of sub-G1 peaks) (Dii) following rotenone or TTFA treatment were determined. Error bars represent s.e. from three independent experiments. * Represents significant difference from control conditions (п& lt0.05). # (A) Represents a lack of significant difference from control conditions (п>0.05).

ROS scavenger tiron decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R), 0.5 mM TTFA (T), and/or tiron (1.0 mM). (A) ROS generation after (i) HEK 293 and (ii) U87 cells were treated with rotenone or TTFA over a 72-hour time course. (B) HEK 293 and U87 cells were treated with tiron alone or in combination with rotenone or TTTF. The percentages of (i) ROS generation, (ii) AVO formation and (iii) GFP-LC3-labeled vacuoles (dots) were determined after 48 hours. (C) Expression of beclin 1 (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) were determined by western blotting after 48 hours in the presence or absence of tiron. Actin was used as a loading control. NH4Cl was used as a lysosomal inhibitor. (Di) Cell death was determined by membrane permeabilization following rotenone or TTFA treatment in the presence or absence of tiron in HEK 293 and U87 cells after 48 hours. (Dii) Apoptosis (formation of sub-G1 peaks) was determined in HEK 293 and U87 cells treated as above. Error bars represent s.e. from three independent experiments. п values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.

ROS scavenger tiron decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA in HEK 293 and U87 cells. Cells were treated with 50.0 μM rotenone (R), 0.5 mM TTFA (T), and/or tiron (1.0 mM). (A) ROS generation after (i) HEK 293 and (ii) U87 cells were treated with rotenone or TTFA over a 72-hour time course. (B) HEK 293 and U87 cells were treated with tiron alone or in combination with rotenone or TTTF. The percentages of (i) ROS generation, (ii) AVO formation and (iii) GFP-LC3-labeled vacuoles (dots) were determined after 48 hours. (C) Expression of beclin 1 (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) were determined by western blotting after 48 hours in the presence or absence of tiron. Actin was used as a loading control. NH4Cl was used as a lysosomal inhibitor. (Di) Cell death was determined by membrane permeabilization following rotenone or TTFA treatment in the presence or absence of tiron in HEK 293 and U87 cells after 48 hours. (Dii) Apoptosis (formation of sub-G1 peaks) was determined in HEK 293 and U87 cells treated as above. Error bars represent s.e. from three independent experiments. п values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.

The above results indicate that overexpression of SOD2 prevents ROS accumulation, autophagy and autophagy-induced cell death. Inversely, the suppression of SOD2 expression might increase ROS generation, autophagy and autophagy-induced cell death. The expression of SOD2 was suppressed by transfection of HeLa cells (wild type) with siRNA against SOD2 (Fig. 6A). Fig. 6B demonstrates that rotenone or TTFA-induced ROS generation was increased from approximately 30% to 50% following transfection with siRNA against SOD2. Similarly, rotenone or TTFA-induced autophagy (formation of AVOs and GFP-LC3-labeled vacuoles) was increased by silencing SOD2 expression with siRNA (Fig. 6C,D). Finally, rotenone and TTFA-induced cell death was increased from 27% to 37% and from 33% to 44%, respectively, by silencing SOD2 expression, and treatment with 3-MA decreased rotenone- and TTFA-induced total cell death to 23% and 27%, respectively, in cells lacking SOD2 (Fig. 6E). However, apoptosis (formation of sub-G1 peaks) induced by rotenone or TTFA was not affected by SOD2 siRNA (Fig. 6F). Когда SOD2 siRNA was transfected into HEK 293 cells, similar results were obtained to those of HeLa cells, with TTFA-induced ROS generation, autophagy (formation of AVOs) and cell death (supplementary material Fig. S9).

Because it was reported that ROS generation could be a downstream effect of autophagy (Yu et al., 2006), we investigated whether the inhibition of autophagy could affect ROS generation induced by mETC inhibitors. Fig. 7 shows that rotenone- and TTFA-induced ROS generation was not affected by the autophagy inhibitor 3-MA or by siRNAs against the autophagy genes beclin 1 or ATG5 in HEK 293 cells. A similar result was obtained in U87 cells: TTFA-induced ROS generation was not affected by siRNAs against the autophagy genes beclin 1 or ATG5 (supplementary material Fig. S10).

Rotenone and TTFA induce apoptosis but not autophagy in non-transformed primary mouse astrocytes

Rotenone and TTFA can induce autophagy and autophagic cell death in transformed cells (HEK 293 cells) and cancer cells (U87 and HeLa cells). The effect of rotenone and TTFA in normal, non-transformed cells is unknown. We isolated normal primary astrocytes from mice and treated the cells with rotenone and TTFA. As shown in Fig. 8A, in mouse astrocytes, rotenone and TTFA failed to significantly induce ROS generation compared with controls over a 48-hour time course. Rotenone and TTFA also failed to significantly increase the amount of AVO formation or GFP-LC3-labeled vacuoles compared with controls, even in the presence of lysosomal inhibitor NH4Cl, over a 48-hour time course (Fig. 8B). In addition, rotenone and TTFA failed to induce a higher amount of beclin 1 expression (Fig. 8Ci). LC3-I expression was undetectable in mouse primary astrocytes compared with the cancer cell lines (Fig. 8Cii). The conversion of LC3-I to LC3-II was unchanged compared to control and NH4Cl increased LC3-II expression, but rotenone or TTFA treatment failed to further increase LC3-II expression (Fig. 8Cii). Mouse astrocytes were still capable of inducing autophagy. Under starvation conditions, LC3-II expression was increased (Fig. 8Cii). In addition, both AVO formation and the amount of GFP-LC3-labeled vacuoles were increased following starvation of mouse astrocytes and were reduced in the presence of 3-MA (supplementary material Fig. S11). Rotenone and TTFA, however, induced cell death in mouse astrocytes (Fig. 8D). This was mainly caused by apoptosis (formation of sub-G1 peaks), as shown in Fig. 8Dii: rotenone and TTFA increased sub-G1 peaks. Therefore, rotenone and TTFA preferentially induced apoptosis in normal non-transformed astrocytes, unlike in the transformed cells.

Overexpression of SOD2 in HeLa cells decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA. Wild-type (wt) and SOD2-overexpressing (SOD2) HeLa cells were treated with rotenone (R, 50.0 μM) or TTFA (T, 0.5 mM) as indicated. (A) ROS generation was determined following 48 hours of rotenone or TTFA treatment. DMSO is a solvent control. (B) AVO formation (i) was determined after 48 hours of treatment with rotenone or TTFA and representative pictures of HeLa (wt and SOD2) cells with GFP-LC3-labeled vacuoles (green dots, ii) were obtained by a fluorescent microscope. In HeLa (wt) cells: a, control b, rotenone c, TTFA. In HeLa (SOD2) cells: d, control e, rotenone f, TTFA. The nucleolus was stained with DAPI (blue). (C) Beclin 1 expression (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) in the presence or absence of NH4Cl (30 mM) was determined by western blot. Actin was used as a loading control. (D) Cell death was determined after cells were treated with rotenone or TTFA in the presence or absence of 3-MA (2.0 mM) and/or zVAD (0.1 mM). * Represents significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and combined treatment with 3-MA and/or zVAD (п& lt0.05). @ Represents significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA (п& lt0.05). # Represents a lack of significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and the combined treatment with 3-MA in SOD2 cells (п>0.05). (E) Apoptosis (formation of sub-G1 peak and TUNEL assay) was determined after treatment with rotenone, TTFA or etoposide (Et, apoptotic stimuli). # Represents significant differences between etoposide treatment and control wt cells. * Represents a lack of significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA alone (п>0.05). Error bars represent s.e. from three independent experiments. п values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.

Overexpression of SOD2 in HeLa cells decreases autophagy and autophagic cell death induced by rotenone and TTFA. Wild-type (wt) and SOD2-overexpressing (SOD2) HeLa cells were treated with rotenone (R, 50.0 μM) or TTFA (T, 0.5 mM) as indicated. (A) ROS generation was determined following 48 hours of rotenone or TTFA treatment. DMSO is a solvent control. (B) AVO formation (i) was determined after 48 hours of treatment with rotenone or TTFA and representative pictures of HeLa (wt and SOD2) cells with GFP-LC3-labeled vacuoles (green dots, ii) were obtained by a fluorescent microscope. In HeLa (wt) cells: a, control b, rotenone c, TTFA. In HeLa (SOD2) cells: d, control e, rotenone f, TTFA. The nucleolus was stained with DAPI (blue). (C) Beclin 1 expression (i) and conversion of LC3-I to LC3-II (ii) in the presence or absence of NH4Cl (30 mM) was determined by western blot. Actin was used as a loading control. (D) Cell death was determined after cells were treated with rotenone or TTFA in the presence or absence of 3-MA (2.0 mM) and/or zVAD (0.1 mM). * Represents significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and combined treatment with 3-MA and/or zVAD (п& lt0.05). @ Represents significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA (п& lt0.05). # Represents a lack of significant difference between rotenone or TTFA treatment alone and the combined treatment with 3-MA in SOD2 cells (п>0.05). (E) Apoptosis (formation of sub-G1 peak and TUNEL assay) was determined after treatment with rotenone, TTFA or etoposide (Et, apoptotic stimuli). # Represents significant differences between etoposide treatment and control wt cells. * Represents a lack of significant differences between wt and SOD2 cells treated with rotenone or TTFA alone (п>0.05). Error bars represent s.e. from three independent experiments. п values less than 0.05 represent significant difference between conditions, as indicated.


Production of ATP using NADH and FADH

So far we have in total, from one glucose molecule.

Now all the hydrogen from the reduced hydrogen carriers enters a chain of reactions, which ultimately yields energy in the form of ATP.

Each hydrogen atom is split into its constituent H + (hydrogen ion) and electron. The electron is the part that actually gets passed down the chain from carrier to carrier. The H+, however, remains in the mitochondrial matrix.

The electron carriers are at successively lower energy levels hence, as the electron moves on from one carrier to the next some energy is released.

This energy is used to pump H + from the matrix into the space between the inner and outer mitochondrial membrane. The H + concentration therefore increases, forming a concentration gradient.

This means that the H + ions have electrical potential energy. H + then flows back down the gradient into the matrix through protein channels.

Associated with each channel is an enzyme, ATP synthase. As the H + ions flow through, their energy is used to make ATP.

This theory about how the ATP is actually made is called the chemiosmotic theory. Oxygen acts as the final electron acceptor in the chain, so the oxygen, electrons and hydrogen ions together form water.

Chemiosmotic theory

For every reduced NAD feeding hydrogen into the chain, enough energy is released to make 3 ATP molecules.
For every reduced FAD feeding hydrogen into the chain, enough energy is released to make 2 ATP molecules.

ATPs made directly = 4
ATPs made from reduced NAD = 10 x 3
ATPs made from reduced FAD = 2 x 2

TOTAL ATPs = 38

Примечание: 38 ATPs will be made under only the most favourable conditions. Usually, slightly less than this will be made per glucose molecule.


An electron transport chain consists of a properly arranged & oriented set of electron carriers transporting electrons in a specific sequence from a reduced nicotinamide coenzyme (NADH) or a reduced flavin prosthetic group (FADH2) to molecular O2.

Transport chain called the mitochondrial respiratory chain, which forms the final path for electron flow from tissue substrates to molecular O2.

At each step, electrons flow from the reluctant of a redox couple, having a lower redox potential to the oxidant of another redox couple possessing a higher redox potential.

The free energy, liberated during the transmitting of electrons along the chain, is used in forming high-energy bonds of ATP.


Modeling the electron transport chain of purple non-sulfur bacteria

*Corresponding author. Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, Sandtorstrasse 1, Magdeburg D-39106, Germany. Tel.: +49 391 6110480 Fax: +49 391 6110509 E-mail: [email protected]

Purple non-sulfur bacteria (Rhodospirillaceae) have been extensively employed for studying principles of photosynthetic and respiratory electron transport phosphorylation and for investigating the regulation of gene expression in response to redox signals. Here, we use mathematical modeling to evaluate the steady-state behavior of the electron transport chain (ETC) in these bacteria under different environmental conditions. Elementary-modes analysis of a stoichiometric ETC model reveals nine operational modes. Most of them represent well-known functional states, however, two modes constitute reverse electron flow under respiratory conditions, which has been barely considered so far. We further present and analyze a kinetic model of the ETC in which rate laws of electron transfer steps are based on redox potential differences. Our model reproduces well-known phenomena of respiratory and photosynthetic operation of the ETC and also provides non-intuitive predictions. As one key result, model simulations demonstrate a stronger reduction of ubiquinone when switching from high-light to low-light conditions. This result is parameter insensitive and supports the hypothesis that the redox state of ubiquinone is a suitable signal for controlling photosynthetic gene expression.

Synopsis

The attractiveness of anoxygenic non-sulfur photosynthetic bacteria (Rhodospirillaceae) for studying gene regulation in response to cellular redox events is based on their energetic flexibility, which enables growth under a variety of environmental conditions. In the presence of oxygen, electrons are transferred through a respiratory chain comprising NADH (or FADH), ubiquinone (Q), cytochrome bc1, cytochrome c2 and finally to oxygen by cytochrome oxidases or ubiquinol oxidases, thereby enabling phosphorylation of ADP via ATPase complexes. Note the functional homology to the mitochondrial respiratory chain. At low oxygen tensions, the biosynthesis of intracytoplasmic membranes (ICMs) is induced. Specific polypeptide-bacteriochlorophyll (BChl) components of these membranes––the photosynthetic light-harvesting complexes (LHCs) and reaction centers (RCs)––capture light energy, which drive a cyclic photophosphorylation system via RC-Q-cyt bc1-cyt c2 back to RC. It has been stated as early as 1957 that the redox state of components of the respiratory and photosynthetic electron transport chain (ETC) may constitute metabolic signals that govern the expression of LHC- and RC-encoding genes and therefore determine the adaptation of the cells to a given environmental condition ( Cohen-Bazire и другие, 1957 ). The repression of ICM synthesis under high oxygen tension and also anaerobically by high light intensities has been studied in detail during the last years and some regulatory systems involved were identified, including the two-component system RegA/RegB (PrrA/PrrB), the PpsR (CrtJ) repressor and the Fnr-like transcriptional regulator FnrL ( Oh and Kaplan, 2000 Bauer и другие, 2003). However, particularly for light regulation of ICM synthesis, the molecular signals and mechanisms involved in the initiation of signal transduction pathways governing photosynthetic gene expression are still poorly characterized or even unidentified. The high-light repression effect has been attributed to be dependent on the redox state of the membranous Q pool ( Oh and Kaplan, 2000 ). However, to our knowledge, no direct experimental measurements of Q redox states under different light conditions are available so far. Recently, it was demonstrated that oxidized Q directly inhibits the RegB/RegA regulatory system of Rhodobacter capsulatus in vitro ( Swem и другие, 2006 ), thereby potentially mediating the repression of ICM synthesis also under high oxygen conditions in the dark.

The lack of quantitative information about how the redox states of individual ETC components change under different growth conditions limits the verification of the proposed hypotheses of redox regulation and a pure qualitative discussion of the behavior of the ETC is infeasible as too many variables are involved. Here, we present (i) a stoichiometric model of the ETC unambiguously describing the structural and functional capabilities of the ETC of purple non-sulfur bacteria and (ii) a kinetic model based on thermodynamic constraints of the underlying processes that enables us to simulate the steady-state behavior of the ETC, in particular the redox states of ETC components, under different environmental conditions.

Elementary-mode analysis (see Schuster и другие, 2000 ) of the ETC reveals nine fundamental modes expressing all the potential functional behaviors of the ETC in the steady state. The stoichiometric model reproduces well-known cycles and pathways for the ETC when operating under photosynthetic (cyclic photosynthesis and reverse electron transport), respiratory (electron transfer from NADH or succinate to ubiquinol oxidase or cytochrome (cbb3) oxidase) or fermentative (fumarate reduction) conditions. Apart from these well-known functions, the stoichiometric model revealed two operational modes representing reverse electron flow under respiratory conditions. So far, the functional role of reverse electron flow has been mainly discussed for photosynthetic growth only. In fact, due to thermodynamic constraints, reverse electron flow under aerobic conditions plays only a minor role and as shown by simulations of the kinetic model, the concentration ratios of the metabolites involved have to be at rather extreme levels, to make this state thermodynamically favorable. However, this operation might become important for certain (possibly temporary) metabolic states, for example, if a great imbalance in the current redox potentials of NADH and succinate occurs.

The stoichiometric model thus identified––in an unbiased way––the meaningful functions of the ETC however, it can only show the potential behaviors of the ETC (which are under real conditions normally superimposed). For studying the actual driving forces, electron flows and redox states occurring in the ETC under different environmental conditions, we therefore constructed a kinetic model that also includes known regulatory pathways governing the expression of ETC components. Although in photosynthetic bacteria two types of energy-converting membranes (ICM and cytoplasmic membrane) are present, which are structurally and functionally different, we set up the model with only one membrane compartment. We justify this approach because we consider in the simulations only scenarios where the model functions either as a pure photosynthetic membrane (ICM model) (i.e. no participation of oxidases) or as a pure respiratory (cytoplasmic) membrane (no participation of photosynthetic RCs). The reaction steps taking place inside the enzyme complexes have been described with rather simple, yet thermodynamically correct kinetic laws based on the differences in the redox potentials of the participating redox couples. As boundary conditions for metabolites directly interacting with the ETC, we fix the concentration ratios of NADH/NAD, succinate/fumarate and ATP/ADP (which can, however, be varied for the different scenarios considered).

To our knowledge, it is the most comprehensive model of the ETC in purple bacteria with respect to the components and processes considered. Even though we cannot claim that the model is accurate when absolute quantitative units are considered (uncertainties in parameters and only few available measurements do not permit this), it provides valuable semiquantitative and qualitative insights into the behavior of the ETC, in particular on the redox states of key components which are often difficult to measure.

Important results of the steady-state analysis of the model are shown in Figure 5. The plots show the dependency of the redox states of the Q and cytochrome c2 pools (Q_charge а также c2_charge), of the proton-motive force (pmf) and BChl concentration (Bchl as a measure of ICM) on the cytosolic redox state (represented by NADH/NAD) for four different growth conditions: aerobic and semi-aerobic in the dark and anaerobic under high-light and low-light conditions. The model is able to reproduce the observations about the ICM levels that are repressed during aerobic growth and are relieved from oxygen repression under semi-aerobic conditions. Importantly, the level of ICM corresponds to the reduction degree of Q. That oxygen-limiting conditions result in a more reduced Q pool compared to fully aerobic growth can be deduced in a straightforward manner from the operation of a linear respiratory chain. In contrast, the adaptation of the Q redox state when the cyclic photophosphorylation system faces different light intensities is not deducible simply by pure intuition. To our knowledge, the question whether a switch from high- to low-light conditions results in a more reduced (as the physiological regulatory model demands to explain high-light repression of ICM synthesis) or a more oxidized Q pool is currently not resolved by literature data. Strikingly, the simulation of this situation with the mathematical model yields an unambiguous result: the Q pool is reduced more under low-light conditions, which is in accordance to its proposed role as a metabolic signal for ICM expression ( Swem и другие, 2006 ). It is important to point out that this finding is virtually independent of the parameter values employed, instead it is an inherent feature of the system. We could not find a parameter set where the opposite result, that is Q gets reduced more under high-light conditions, is produced.

Another conclusion that can be drawn from Figure 5 is, that (only) under photosynthetic conditions there is an optimal load of the ETC with electrons (and therefore an optimal cytosolic redox state here reflected by the ratio NADH/NAD) resulting in a maximum of Δп. The model clearly demonstrates that the optimal load is dependent on the light intensity. Such a biphasic behavior cannot be seen for respiratory growth: Δп increases monotonically with the cytosolic redox state.

These results illustrate the value and applicability of the model presented in deriving predictions on the behavior of the ETC in anoxygenic photosynthetic bacteria, which await experimental validation now.


Bahr, J.T. and W.D. Bonner, Jr.: Cyanide-insensitive respiration. I. The steady state of skunk cabbage spadix and bean hypocotyl mitochondria. J. biol. Chem. 248, 3441–3445 (1973a)

——: Cyanide-insensitive respiration. II. Control of the alternate pathway. J. biol. Chem. 248, 3446–3550 (1973b)

Camerino, P.W. and T.E. King: Studies on cytochrome oxidase in soluble and particulate forms. J. biol. Chem. 241, 970–979 (1966)

Chance, B.: Enzyme mechanisms in living cells. В: A symposium of enzyme action, pp 399–453. Эд. by W.D. McElroy and B. Glass. Baltimore: Johns Hopkins Press 1954

—: Reaction of oxygen with the respiratory chain in cells and tissues. J. gen. Physiol. 49, 163–188 (1965)

—, W.D. Bonner, Jr. and B.T. Storey: Electron transport in respiration. A. Rev. Pl. Physiol. 19, 295–320 (1968)

—, L. Ernster, P.B. Garland, C.P. Lee, P.A. Light, T. Ohnishi, C.I. Ragan and D. Wong: Flavoproteins of the mitochondrial respiratory chain. Proc. натн. Акад. Sci. СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ. 57, 1498–1505 (1967)

— and G.R. Williams: Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. VI. The effects of adenosine diphosphate on azide-treated mitochondria. J. biol. Chem. 221, 447–489 (1956a)

——: The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. 27, 65–134 (1956b)

Curl, H.C., Jr. and J. Sandberg: The measurement of dehydrogenase activity in marine organisms. J. mar. Res. 19, 123–138 (1961)

Ernster, L., M. Ljunggren and L. Danielson: Purification and some properties of highly dicumarol-sensitive liver diaphorase. Biochem. биофиз. Res. Commun. 2, 88–92 (1960)

Gahan, P.B. and M. Kalina: The use of tetrazolium salts in the histochemical demonstration of succinic dehydrogenase activity in plant tissue. Histochemie 14, 81–88 (1968)

Green, D.E.: The mitochondrion. Scient. Являюсь. 210, 63–74 (1964)

Hatefi, Y.: Oxidation of reduced triphosphopyridine nucleotide by submitochondrial particles from beef heart. Biochem. биофиз. Res. Commun. 50, 978–984 (1973)

Kenner, R.A. and S.I. Ahmed: Correlation between oxygen utilization and electron transport activity in marine phytoplankton. Mar. Biol. 33, 129–133 (1975)

Lambowitz, A.M., E.W. Smith and C.W. Slayman: Electron transport in Neurospora mitochondria Studies on wild type and poky. J. biol. Chem. 247, 4850–4858 (1972a)

———: Oxidative phosphorylation in Neurospora митохондрии. Studies on wild type, poky, and chloramphenicol-induced wild type. J. biol. Chem. 247, 4859–4865 (1972b)

Lester, R.L. and A.L. Smith: Studies on the electron transport system. XXVIII. The mode of reduction of tetrazolium salts by beef heart mitochondria role of coenzyme Q and other lipids. Биохим. биофиз. Acta 47, 475–496 (1961)

Linnane, A.W., E. Vitols and P.C. Nowland: Studies on the origin of yeast mitochondria. J. Cell Biol. 13, 345–350 (1962)

Nachlas, M.M., S.I. Margulies and A.M. Seligman: A colorimetric method for the estimation of succinic dehydrogenase activity. J. biol. Chem. 235, 449–503 (1960a)

———: Site of electron transfer to tetrazolium salts in the succinoxidase system. J. biol. Chem. 235, 2739–2743 (1960b)

Ohnishi, T., K. Kawaguchi and B. Hagihara: Preparation and some properties of yeast mitochondria. J. biol. Chem. 241, 1797–1806 (1966a)

—, G. Sottocas and L. Ernster: Current approaches to the mechanism of energy-coupling in the respiratory chain. Studies with yeast mitochondria. Бык. Soc. Чим. biol. 48, 1189–1203 (1966b)

Packard, T.T.: The measurement of respiratory electron transport activity in marine plankton. J. mar. Res. 29, 235–244 (1971)

— and M.L. Healy: Electrochemical standardization of the dehydrogenase assay used in the estimation of respiratory rates. J. mar. Res. 26, 66–74 (1968)

—— and F.A. Richards: Vertical distribution of the activity of the respiratory electron transport system in marine plankton. Лимнол. Oceanogr. 16, 60–70 (1971)

Pavlou, S.P.: Phytoplankton growth dynamics. Technical Series 1. Chemostat methodology and chemical analyses. Спец. Rep. Dep. Oceanogr. Univ. Wash. 52, 1–130 (1972)

Siekevitz, P.: Origin and functional nature of microsomes. Fedn Proc. Fedn Am. Socs exp. Биол. 24, 1153–1155 (1965)

Strittmatter, P.: Microsomal electron transport. В: Biological oxidations, pp 171–192. Эд. by T.P. Singer. New York: Wiley Interscience 1968

Udenfriend, S., S. Stein, P. Bohlen, W. Dairman, W. Leimbruber and M. Weigele: Applications of fluorescamine, a new reagent for amino acids, peptides, proteins and other primary amines in the picomole range. Science, N.Y. 178, 871–872 (1972)

Vitols, E. and A.W. Linnane: Studies on the oxidative metabolism of Saccharomyces cerevisiae. II. Morphology and oxidative phosphorylation capacity of mitochondria and derived particles from Baker's yeast. J. biophys. biochem. Cytol. 9, 701–710 (1961)

Weigele, M., S. Debernardo, J. Tengi and W. Leimgruber: A novel reagent for the fluorometric assay of primary amines. Варенье. chem. Soc. 94, 5927–5928 (1972)


Смотреть видео: Dorin Chirtoacă,,nu simpatizează sistemul electronic de taxare (August 2022).