Информация

Дизайн грунтовки с помощью Primer-BLAST на определенном участке

Дизайн грунтовки с помощью Primer-BLAST на определенном участке



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я пытаюсь создать праймеры с использованием Primer-BLAST таким образом, чтобы прямой праймер охватывал определенный сайт пары оснований.

Я смотрю на KRAS, для которого я считаю RefSeq ID является NG_007524.1 и передний праймер должен охватывать chr12: 25398285.

Однако я не уверен, как ограничить дизайн для этого. Спасибо.


Я думаю, что можно применить разные способы, но самый простой способ - указать диапазон для установки прямого праймера.

Определите длину грунтовки, которую вы собираетесь получить.

Допустим, вы хотите 25 мер.

Вы можете установить диапазон от chr12: 25398261 к chr12: 25398309.

Когда вы определяете, где chr12: 25398285 в NG_007524.1, вы готовы разработать свои грунтовки.


Дизайн праймеров с помощью Primer-BLAST на определенном участке - Биология

Правила использования PrimerBank

PrimerBank - это общедоступный ресурс для праймеров для ПЦР. Эти праймеры предназначены для обнаружения или количественной оценки экспрессии генов (ПЦР в реальном времени). Существует несколько способов поиска праймеров: по доступу в GenBank, по присоединению белка NCBI, по идентификатору LocusLink, идентификатору PrimerBank или по ключевому слову (описанию гена). PrimerBank содержит около 180 000 праймеров, охватывающих большинство известных генов человека и мыши.

Амплификация полимеразной цепной реакции (ПЦР) - один из наиболее активно используемых методов в молекулярной биологии. В последние годы ПЦР все чаще используется для обнаружения или количественной оценки экспрессии генов. Это более удобный метод исследования экспрессии генов по сравнению с другими методами, такими как Нозерн-блоттинг. Одной из распространенных проблем ПЦР является неспецифическая амплификация продуктов других генов, поскольку библиотеки кДНК из тысяч генов часто используются в качестве матриц ПЦР. Следовательно, нам необходимо тщательно разработать праймеры для ПЦР, которые специфически амплифицируют интересующие гены. К сожалению, большинство доступных программ конструирования праймеров сосредотачиваются только на химических свойствах праймера, таких как температура плавления, содержание GC, вторичная структура и т. Д. Мало внимания уделяется ошибочному использованию праймера для других генов. Напротив, все праймеры в PrimerBank были тщательно разработаны для обеспечения специфичности генов.

Алгоритм конструирования праймеров был тщательно протестирован экспериментами ПЦР в реальном времени на предмет специфичности и эффективности ПЦР. Мы протестировали 26 855 пар праймеров, которые соответствуют 27 681 гену мыши, с помощью ПЦР в реальном времени с последующим электрофорезом в агарозном геле и секвенированием продуктов ПЦР. Процент успеха дизайна составляет 82,6% (22 187 успешных пар праймеров) на основе электрофореза в агарозном геле.

Вы можете выполнить поиск в PrimerBank по доступу в GenBank, доступу к белку NCBI, идентификатору LocusLink, символу гена NCBI или идентификатору PrimerBank.

Условия поиска автоматически объединяются, если они разделены пробелом. Например, поиск «киназа s6» возвращает все записи с обоими ключевыми словами «киназа» И «s6». Также можно использовать логические операторы AND и OR. Вот несколько примеров:

Ключевое слово Интерпретация
киназа s6 Поиск как киназы, так и s6
киназа и s6 Поиск как киназы, так и s6
Цитохром или цип Поиск цитохрома или cyp

В настоящее время возможен поиск только ограниченного набора ключевых слов (ключевых слов, определенных в определениях белков). Например, вы не можете искать по символам генов. Если вы не нашли свои гены, найдите соответствующие идентификаторы генов (образцы ДНК, образцы белков или идентификаторы LocusLink) и выполните поиск по идентификаторам.

Из-за избыточности последовательностей в GenBank каждый ген обычно представлен более чем одной записью NCBI. PrimerBank иногда использует индексный файл NCBI LocusLink для сопоставления нескольких записей последовательностей с одним и тем же локусом гена. В результате может быть получен другой инвентарный номер, отличный от первоначально представленного. Однако оба образца представляют один и тот же ген. Если полученная запись имеет другой доступ в GenBank, в поле описания гена появится идентификатор LocuLink.

Вы можете использовать функцию сохранения вашего браузера, чтобы сохранить веб-страницу на вашем локальном компьютере. Другие варианты сохранения будут реализованы позже.

Все праймеры в PrimerBank были созданы с помощью программы uPrimer. Большое внимание было уделено тому, чтобы не допустить ошибочного старта праймера к другим известным генам в геноме. Вот список критериев для дизайна праймеров для конкретных генов:

  1. Диапазон длин праймеров: 19–23 н., Оптимальная длина - 21 н.
  2. Диапазон процентного содержания праймера GC: 35% - 65%.
  3. Значение дельта G для пяти 3-х концевых оснований составляет не менее -9 ккал / моль.
  4. Диапазон Tm праймера: 60-63 ° C, определенный методом ближайшего соседства.
  5. Диапазон длин продуктов ПЦР составляет 100 - 250 п.н. Если это требование не может быть выполнено, будут использоваться альтернативные диапазоны.
  6. По умолчанию количество пар праймеров, разработанных для каждой последовательности, равно 3.
  7. Никакой праймер не предназначен для регионов с низкой сложностью.
  8. Праймер не содержит 6 или более смежных одинаковых нуклеотидов.
  9. Праймер не содержит неоднозначных нуклеотидов.
  10. Никаких повторяющихся 15-мер из последовательностей других генов в геноме (для обеих цепей) где-либо в праймере.
  11. Никаких повторяющихся 13-мер из некодирующих последовательностей РНК (для обеих цепей) где-либо в праймере.
  12. Общий балл BLAST для любого праймера составляет менее 30 (эквивалентно 15-мерному точному совпадению).
  13. Максимальная Tm для 3-го конца, идеально совпадающего с последовательностями других генов, не превышает 46 ° C, не превышает 42 ° C по сравнению с некодирующими последовательностями РНК (Tm определяется методом ближайшего соседства).
  14. Для вторичной структуры праймера (самоотжиг праймер-праймер)
    1. Повторение 5-мер не допускается где-либо, когда последовательность праймера сравнивается с его комплементарной цепью.
    2. Четыре основания с 3 концом должны быть уникальными по сравнению с комплементарной цепью праймера.
    1. Повторение 9-мер не допускается, когда последовательность праймера сравнивают с комплементарной цепью его родственной последовательности.
    2. Оценка BLAST меньше 18, когда последовательность праймера сравнивают с комплементарной цепью его родственной последовательности.

    Все грунтовки в PrimerBank имеют температуру плавления (Tm) от 60 до 63 ° C. Более высокая температура отжига приводит к более специфическому грунтованию. Предыдущие исследования показали, что у праймера Tm должно происходить достаточное праймирование. Поэтому для всех грунтовок PrimerBank рекомендуется температура отжига 60 ° C. Неспецифические продукты ПЦР могут возникать при более низкой температуре отжига. Мы протестировали несколько сотен праймеров при температуре отжига 60 ° C, и эксперименты с ПЦР прошли очень хорошо.

    Значения Tm праймера рассчитываются с использованием метода ближайшего соседа с современными термодинамическими параметрами. Значения Tm также зависят от концентрации праймера и соли. Более высокие концентрации праймера и соли обычно приводят к более высокой Tm. Значения Tm, включенные в PrimerBank, относятся к 0,25 мкМ праймера, 1,5 мМ Mg2 +, 50 мМ Na + и 0,8 мМ dNTP, которые обычно используются в экспериментах ПЦР. Другие общие условия ПЦР лишь незначительно влияют на Tm.

    Чтобы гарантировать эффективность ПЦР, рекомендуется использовать небольшие продукты ПЦР. Большинство праймеров PrimerBank приводят к ампликонам размером от 100 до 250 п.н. В этом диапазоне эффективность ПЦР близка к 100% (подтверждается экспериментами ПЦР в реальном времени). Однако эффективность ПЦР может быть снижена для более крупных продуктов ПЦР. Менее 1% праймеров PrimerBank приводят к ампликонам размером & gt400 п.н. Будьте осторожны с эффективностью ПЦР при использовании этих праймеров.

    Иногда желательно выбрать пару праймеров, охватывающих интрон. Таким образом можно тщательно контролировать загрязнение геномной ДНК. Обычно пара праймеров PrimerBank охватывает интрон, потому что типичный экзон довольно мал. Информация, охватывающая интроны праймера, будет включена в следующее обновление версии. Если для вас важно убедиться, что пара праймеров охватывает интрон, вы можете просто выполнить поиск BLAST последовательностей пар праймеров или, что лучше, последовательностей ампликонов (перечисленных на странице сведений о праймерах) по геномным последовательностям.

    Электрофорез в агарозном геле или анализ кривой плавления не всегда могут достоверно отражать специфичность ПЦР. По нашему опыту, бимодальные кривые плавления иногда наблюдаются для длинных ампликонов, даже если ПЦР специфичны. Наблюдаемая неоднородность температуры плавления была связана с неоднородностью внутренней последовательности (например, независимо плавящиеся блоки с высоким и низким содержанием GC), а не с загрязнением ампликона. С другой стороны, для коротких ампликонов на агарозном геле иногда наблюдаются очень слабые полосы, мигрирующие перед основными специфическими полосами. Эти слабые полосы являются сверхструктурированными или одноцепочечными версиями конкретных ампликонов в равновесном состоянии. Хотя гель-электрофорез или анализ кривой плавления сами по себе не могут быть надежными на 100%, по нашему опыту, их комбинация всегда может выявить специфичность ПЦР.

    Хотя все праймеры PrimerBank разработаны с учетом специфики генов, нам все же необходимо быть очень осторожными с условиями ПЦР.

    Неспецифическое удлинение праймера только на несколько оснований при низкой температуре с помощью ДНК-полимеразы может легко привести к неспецифическим ПЦР-амплификациям. Поэтому НАСТОЯТЕЛЬНО рекомендуется ПЦР с горячим стартом. Фактически, в своих экспериментах я использую только ПЦР с горячим стартом. Я обычно использую полимеразу AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) для ПЦР с горячим стартом.

    Температура отжига может повлиять на специфичность ПЦР. Чтобы избежать неспецифических продуктов ПЦР, рекомендуется высокая температура отжига (меньшее из двух значений Tm пары праймеров) и короткое время отжига.

    Если вы все еще видите неспецифические полосы, это может означать, что проблема в используемой паре праймеров. Несмотря на то, что при разработке грунтовок PrimerBank уделялось большое внимание, вероятность успеха не является 100%. Менее 1% грунтовок могут иметь проблемы с дизайном (подробное обсуждение см. В нашей статье). В этом случае попробуйте другую пару праймеров для того же гена. Щелкните здесь, если хотите сообщить о проблемах с грунтовкой.

    Плохое качество ПЦР-матриц, праймеров или реагентов может привести к ошибкам ПЦР. Во-первых, включите соответствующие элементы управления, чтобы исключить эти возможности.

    Некоторые гены экспрессируются только в определенных тканях. Пожалуйста, сначала прочтите литературу, чтобы убедиться, что ваши гены включены в шаблоны кДНК. По нашему опыту, это наиболее вероятная причина отрицательных результатов ПЦР. Если вы уверены, что гены экспрессируются, попробуйте снизить температуру отжига (до Tm - 5 & degC) и увеличить время отжига, чтобы обеспечить достаточный отжиг праймера.

    Если вы по-прежнему не видите полосу ПЦР, это может означать, что проблема в используемой паре праймеров. Несмотря на то, что при разработке грунтовок PrimerBank уделялось большое внимание, вероятность успеха не является 100%. Менее 1% грунтовок могут иметь проблемы с дизайном (подробное обсуждение см. В нашей статье). В этом случае попробуйте другую пару праймеров для того же гена. Щелкните здесь, если хотите сообщить о проблемах с грунтовкой.

    Алгоритм и первоначальное тестирование PrimerBank были созданы Wang and Seed, Xiaowei Wang и Brian Seed (2003). Банк праймеров для ПЦР для количественного анализа экспрессии генов. Nucleic Acids Research 31 (24): e154 pp.1-8. Дальнейшее уточнение и проверка всей коллекции мышей были выполнены Spandidos и соавторами. Athanasia Spandidos, Xiaowei Wang, Huajun Wang, Stefan Dragnev, Tara Thurber и Brian Seed (2008) Полная коллекция экспериментально подтвержденных праймеров для количественного определения количества транскриптов мыши с помощью полимеразной цепной реакции. BMC Genomics 2008, 9: 633


    Primer-BLAST: инструмент для разработки целевых праймеров для полимеразной цепной реакции

    Выбор подходящих праймеров, вероятно, является самым важным фактором, влияющим на полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Специфическая амплификация намеченной мишени требует, чтобы праймеры не соответствовали другим мишеням в определенных ориентациях и на определенных расстояниях, которые допускают нежелательную амплификацию. Процесс создания конкретных праймеров обычно включает два этапа. Во-первых, праймеры, фланкирующие интересующие области, генерируются либо вручную, либо с использованием программных средств, затем они просматриваются в соответствующей базе данных нуклеотидных последовательностей с использованием таких инструментов, как BLAST, для исследования потенциальных мишеней. Однако последний процесс является непростым, поскольку необходимо изучить многие детали между праймерами и мишенями, такие как количество и положение совпадающих оснований, ориентация праймеров и расстояние между прямым и обратным праймерами. Сложность такого анализа обычно делает это трудоемкой и очень сложной задачей для пользователей, особенно когда праймеры имеют большое количество совпадений. Кроме того, хотя программа BLAST широко использовалась для обнаружения праймеров-мишеней, на самом деле она не является идеальным инструментом для этой цели, поскольку BLAST является алгоритмом локального выравнивания и не обязательно возвращает полную информацию о совпадении по всему диапазону праймеров.


    Основные принципы RT-qPCR

    Количественная ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR) используется, когда исходным материалом является РНК. В этом методе РНК сначала транскрибируется в комплементарную ДНК (кДНК) обратной транскриптазой из общей РНК или информационной РНК (мРНК). Затем кДНК используется в качестве матрицы для реакции qPCR. RT-qPCR используется во множестве приложений, включая анализ экспрессии генов, проверку РНКи, проверку микрочипов, обнаружение патогенов, генетическое тестирование и исследование заболеваний.

    Одноэтапная и двухэтапная RT-qPCR

    RT-qPCR может выполняться в одно- или двухэтапном анализе (Рисунок 1, Таблица 1). Одноэтапные анализы объединяют обратную транскрипцию и ПЦР в одной пробирке и буфере с использованием обратной транскриптазы вместе с ДНК-полимеразой. В одноэтапной RT-qPCR используются только праймеры, специфичные для последовательности. В двухэтапных анализах этапы обратной транскрипции и ПЦР выполняются в отдельных пробирках с разными оптимизированными буферами, условиями реакции и стратегиями прайминга.

    Рисунок 1. Одноэтапная и двухэтапная RT-qPCR.

    Таблица 1. Преимущества и недостатки при использовании одноэтапных и двухэтапных анализов в RT-qPCR

    • Меньше экспериментальных вариаций, поскольку обе реакции происходят в одной и той же пробирке.
    • Меньшее количество этапов дозирования снижает риск заражения
    • Подходит для высокопроизводительной амплификации / скрининга
    • Быстро и легко воспроизводимо
    • Невозможно оптимизировать две реакции по отдельности
    • Менее чувствителен, чем двухступенчатый, потому что условия реакции являются компромиссом между двумя комбинированными реакциями.
    • Обнаружение меньшего количества целей на образец
    • Создается стабильный пул кДНК, который можно хранить в течение длительных периодов времени и использовать для множества реакций.
    • Гены-мишени и контрольные гены могут быть амплифицированы из одного пула кДНК без мультиплексирования.
    • Оптимизированные реакционные буферы и реакционные условия могут использоваться для каждой отдельной реакции.
    • Гибкие варианты грунтования
    • Использование нескольких пробирок и этапов пипетирования подвергает реакцию большему риску заражения ДНК.
      Кропотливый
    • Требуется больше оптимизации, чем одношаговая

    Выбор общей РНК против мРНК

    При разработке анализа RT-qPCR важно решить, использовать ли общую РНК или очищенную мРНК в качестве матрицы для обратной транскрипции. мРНК может обеспечить немного большую чувствительность, но часто используется общая РНК, поскольку она имеет важные преимущества перед мРНК в качестве исходного материала. Во-первых, требуется меньшее количество стадий очистки, что обеспечивает более количественное извлечение матрицы и лучшую способность нормализовать результаты к начальному количеству клеток. Во-вторых, избегая любых этапов обогащения мРНК, можно избежать возможности искажения результатов из-за разных выходов восстановления для разных мРНК. Взятые вместе, общая РНК более подходит для использования в большинстве случаев, поскольку относительная количественная оценка целей более важна для большинства приложений, чем абсолютная чувствительность обнаружения 1.

    Праймеры для обратной транскрипции

    Для реакций праймирования кДНК в двухэтапных анализах можно использовать три различных подхода: праймеры олиго (dT), случайные праймеры или праймеры, специфичные для последовательности (Рисунок 2, Таблица 2). Часто используется смесь олиго (dT) s и случайных праймеров. Эти праймеры отжигаются с цепью матричной мРНК и обеспечивают ферменты обратной транскриптазы отправной точкой для синтеза.

    Фигура 2. Четыре различных метода праймирования для этапа обратной транскрипции в двухэтапных анализах RT-qPCR.

    Таблица 2. Рекомендации по использованию праймеров для стадии синтеза кДНК RT-qPCR. Комбинация случайных праймеров и закрепленных олиго (dT) праймеров улучшает эффективность обратной транскрипции и чувствительность кПЦР.

    • Получение полноразмерной кДНК из мРНК с поли (A) хвостовиком
    • Хорошо использовать, если доступно мало исходного материала
    • Якорь гарантирует, что праймер олиго (dT) связывается на 5'-конце поли (A) хвоста мРНК.
    • Только амплифицируйте ген с поли (А) хвостом
    • Усеченная кДНК из внутренних сайтов поли (А) праймирования * 2
    • Смещение в сторону 3 'конца *
    • Отжиг ко всей РНК (тРНК, рРНК и мРНК)
    • Хорошо использовать для стенограмм со значительными вторичными структурами или если доступно мало исходного материала.
    • Высокий выход кДНК
    • кДНК состоит из всех РНК, что не всегда желательно и может ослаблять сигнал мРНК.
    • Усеченная кДНК
    • Специфический пул кДНК
    • Повышенная чувствительность
    • Используйте праймер для обратной КПЦР
    • Синтез ограничен одним интересующим геном

    Ферменты обратной транскриптазы

    Обратная транскриптаза - это фермент, который производит ДНК из РНК. Некоторые ферменты обладают РНКазной активностью по разрушению цепи РНК в гибриде РНК-ДНК после транскрипции. Если фермент не обладает активностью РНКазы, можно добавить РНКазу H для повышения эффективности КПЦР. Обычно используемые ферменты включают обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей Молони и обратную транскриптазу вируса миелобластоза птиц. Для RT-qPCR идеально выбрать обратную транскриптазу с высокой термостабильностью, поскольку это позволяет проводить синтез кДНК при более высоких температурах, обеспечивая успешную транскрипцию РНК с высоким уровнем вторичной структуры, сохраняя при этом их полную активность на протяжении всей реакции. получение более высоких выходов кДНК.

    РНКаза H Активность обратной транскриптазы

    Активность РНКазы H разрушает РНК из дуплексов РНК-ДНК, обеспечивая эффективный синтез двухцепочечной ДНК. Однако при использовании длинных матриц мРНК РНК может преждевременно разрушаться, приводя к усеченной кДНК. Следовательно, как правило, полезно минимизировать активность РНКазы H при стремлении продуцировать длинные транскрипты для клонирования кДНК. Напротив, обратные транскриптазы с внутренней активностью РНКазы H часто используются в приложениях кПЦР, поскольку они усиливают плавление дуплекса РНК-ДНК во время первых циклов ПЦР (Рисунок 3).

    Рисунок 3. РНКаза H Активность обратных транскриптаз. В кПЦР используйте обратную транскриптазу с активностью РНКазы.


    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Поиск в PubMed выполнялся с использованием поисковых терминов «ChIP-seq», «ChIP-qPCR» и «Chromatin Immunoprecipitation», а публикации вручную проверялись на предмет экспериментов ChIP-qPCR. Праймеры ChIP-qPCR были включены, когда протокол эксперимента и описание праймера не были двусмысленными, и исследование показало, что обогащение qPCR по крайней мере в 5 раз превышает допустимый контроль. Названия генов были проверены с помощью базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) для правильной номенклатуры. В случаях, когда использовались старые названия генов или псевдонимы, название гена было заменено правильным названием, а в записи базы данных была сделана отметка с указанием исходного названия гена, использованного авторами. Кроме того, было добавлено полное название гена («Описание») вместе с используемым антителом, видом и клеточной линией или тканью, которые использовались в эксперименте. Если авторы сообщали об обогащении только тогда, когда клетки или животные не относились к дикому типу (например, лечили, стимулировали, нокдаун генов), мы указывали условия в примечаниях к соответствующей записи в базе данных. Идентификатор PubMed был включен и отображается как прямая интерактивная ссылка в пользовательском интерфейсе, открывающая новое окно браузера, ведущее к исходной публикации на веб-сайте NCBI. Температура плавления (Тм) рассчитывали с помощью OIigoCalc (23) с учетом 50 нМ праймеров и 50 мМ соли (Na +). Все записи были перепроверены двумя независимыми исследователями.


    Методы

    Условия роста растений, а также молекулярно-биологические методы, использованные для получения данных, используемых в этом исследовании, описаны в [3]. Общие аспекты базы данных описаны в [9, 21]. Все FST, созданные в GABI-Kat, общедоступны через ENA / GenBank и SimpleSearch.

    Терминология

    Мы используем термин «ампликон» для обозначения фрагмента ДНК, который был физически сформирован после ПЦР и который можно секвенировать. Термин «амплимер» относится к теоретической конструкции, которая состоит из пары праймеров (расположенных на противоположных цепях и с их 3'-концами, направленных друг к другу) и соответствующей исходной последовательности. Например, можно сконструировать несколько амплимеров, обращающихся к предсказанному сайту вставки Т-ДНК, но только пару праймеров, которая основана на правильных предсказаниях и / или предположениях о конфигурации слияния Т-ДНК с геномной ДНК изучаемого аллеля вставки. позволит успешно сформировать ампликон.

    Категоризация сайтов для вставки

    Оценка FST для прогнозирования сайтов инсерции была основана на совпадениях (взвешенных сходствах последовательностей), созданных BLAST [8], и с использованием последовательности генома TAIRv10 и набора данных аннотаций [22]. Первоначально сохранялось только лучшее попадание BLAST для каждого FST [18]. Чтобы обратиться к паралогическим предсказаниям, а также к «составным FST», которые содержат части последовательности, полученные как минимум из двух независимых сайтов вставки, мы изменили внутреннюю базу данных GABI-Kat, чтобы можно было хранить несколько прогнозов сайтов вставки для каждого отдельного FST. Новые прогнозы были классифицированы на основе e-значения попадания BLAST. Категория 0 присваивается прогнозу, выведенному из наилучшего совпадения BLAST, пока его значение e ниже (лучше) 1e-3. «Лучшие» совпадения с большими (менее значимыми) значениями e были отнесены к категории 2. Для каждого FST может быть только одно лучшее совпадение, и это совпадение выбирается с помощью попадания в начало списка в выходных данных BLAST. , что приводит к предсказанию категории 0. Обратите внимание, что лучший результат может оказаться на верхней позиции случайно, если соответствующая область FST попадет в несколько частей генома с идентичными значениями e и оценками. Если есть дополнительные совпадения из одного и того же FST с e-значениями ниже 1e-3, полученные прогнозы классифицируются как категория 1. Если разные регионы одного и того же FST имеют совпадения в разных частях генома, эти регионы обрабатываются индивидуально, чтобы покрыть случаи вывода нескольких вставок из одного составного FST. Из каждой из этих областей (и в дополнение к единственному предсказанию категории 0 для полного FST) используется максимум 3 совпадения для создания предсказаний категории 1, дальнейшие совпадения BLAST игнорируются. Это ограничение необходимо для уменьшения объема лабораторных работ, вызванных областями FST, которые не только паралогичны, но и повторяются. Для дальнейшей фильтрации выведенные сайты вставки (i) должны находиться на расстоянии 1000 пар оснований друг от друга, чтобы их можно было рассматривать как новый прогноз вставки, если они расположены ближе друг к другу, им назначается один и тот же прогноз, и (ii) отбрасываются, если разница значений e для наилучшего совпадения для одной области FST больше, чем коэффициент 1e10. В общем, наш последующий анализ рассматривал только прогнозы категорий 0 и 1.

    Определение групп паралогов

    Для систематической обработки прогнозов вставки, которые попадают в паралогичные области, мы сгруппировали их в группы, используя подход иерархической кластеризации для всех прогнозов, сгенерированных для данной линии GABI-Kat (очевидно, это было сделано для всех строк). Начиная с групп, содержащих по одному прогнозу в каждой, группы объединяли, если для каждой возможной комбинации прогнозов между двумя отдельными группами выполнялось одно из следующих условий: (i) прогноз для разных локусов был основан на одной и той же части последовательности FST ( с минимальным перекрытием 30 п.н.) (ii) последовательность 400 п.н. рядом с предсказанным сайтом встраивания имеет идентичность более 79% для всех членов группы. Кластеризация прекратилась, когда не удалось объединить другие группы. Все группы, которые содержали как минимум два прогноза для различных вставок (т.е. они должны отображать расстояние более 1000 пар оснований), были сохранены.

    Конструкция праймера позволяет избежать множественных участков отжига на 3'-конце

    Праймер считался «уникальным», если его 3'-конец из 12 п.н. имел только одно попадание в последовательность генома. Количество вхождений каждой последовательности длиной 12 пар оснований в геноме было предварительно вычислено и сохранено в нашей базе данных. Используя этот индекс, можно легко определить количество возможных подходящих позиций для каждого праймера с помощью простого и быстрого запроса к базе данных.

    Мы разработали два метода дизайна грунтовки. Один основан на широко используемом инструменте конструирования праймеров Primer3 [23] с дополнительной фильтрацией, другой использует саморазработанный алгоритм, который ищет несовпадения в пределах множественного выравнивания целевых зон, связанных с последовательностью. Для внутреннего подтверждения в GABI-Kat праймеры для вставок, которые не расположены в паралогичных регионах, конструируются с использованием первого метода, а второй метод применяется к вставкам в паралогичных регионах. Инструмент для разработки общедоступных праймеров работает для всех должностей в A. thaliana геном, не зависит от (предсказанных) сайтов вставки GABI-Kat и автоматически выбирает лучший метод для адресуемого геномного локуса. Чтобы решить, какой метод лучше всего подходит для рассматриваемой целевой зоны, выполняется BLAST последовательностей этой зоны (то есть последовательностей, окружающих целевую позицию, ограниченную значением, установленным для расстояния до целевой позиции). в A. thaliana последовательность генома с отсечкой е-значения 1e-5, которая достаточно высока для обнаружения совпадений длиной до 24 п.н. Если в целевой зоне есть часть последовательности, у которой нет других попаданий в A. thaliana генома и имеет длину не менее 100 п.н., проблем с паралогическими участками возникать не должно, и используется метод на основе Primer3. Если такая уникальная часть последовательности не может быть определена в последовательности целевой зоны, выбирается метод конструирования праймера паралога.

    Метод на основе Primer3

    Чтобы найти праймеры-кандидаты в целевой зоне, сначала используется часть целевой зоны без дополнительных паралоговых областей в геноме (идентифицированная во время принятия решения, какой метод конструирования праймеров следует использовать). Эта часть последовательности целевой зоны делится на перекрывающиеся окна размером не менее 80 п.н., и для каждого из этих окон Primer3 конструирует праймер. Окна перекрываются с шагом 30 п.н., чтобы также учитывать возможные грунтовки на концах окон. Для дальнейшего увеличения количества возможных грунтовок выбранная температура плавления изменяется с шагом 0,4 ° C до максимально 1,2 ° C ниже или выше заданной температуры плавления. Все праймеры проверяют на уникальность их 3'-конца, как описано выше. Как только обнаруживается праймер, имеющий только одно попадание в геном длиной 12 пар оснований, разработка праймера завершается успешно. Если первоначальный поиск в уникальной части целевой зоны не дал результата, процедура повторяется во всей последовательности целевой зоны с размером окна не менее 110 п.н. и чередующимися температурами плавления таким же образом, как описано выше. Если не удалось найти уникальный праймер, то праймер с наименьшим количеством совпадений в 12 пар оснований среди всех праймеров, созданных в течение всего процесса, рассматривается как лучший из возможных праймеров для этой целевой зоны.

    Метод праймера Paralog

    В зонах-мишенях, которые действительно имеют паралоги по всей их последовательности где-то в геноме, подход на основе Primer3 часто не приводит к удовлетворительным результатам. Наш алгоритм сначала идентифицирует все потенциально паралоги в геноме с помощью начального BLAST с отсечкой e-значения 1e-5 и минимально необходимой длиной 50 пар оснований. Все попадания удлинены, чтобы соответствовать длине целевой зоны, и множественное выравнивание вычисляется с помощью ClustalW [24]. Чтобы сократить время выполнения ClustalW, для вычисления множественных выравниваний используется подход со скользящим окном с перекрывающимися окнами размером около 220 бит / с (и перекрытием 30 бит / с). В этих множественных выравниваниях алгоритм ищет позиции с максимальным количеством несовпадений с последовательностью целевой зоны. Это положение определяется как 3'-конец возможного праймера и удлиняется, чтобы соответствовать желаемой температуре плавления. После этого праймер-кандидат проверяется на GC-Clamp (1-3 G / C в последних 5 нуклеотидах), повторы оснований (менее 5 идентичных нуклеотидов в ряду), GC-содержание (от 40 до 60%) и вторичные структуры (последние 5 нуклеотидов не должны появляться в праймере как обратный комплемент). Чем больше этих условий выполняется, тем лучше праймер - праймеры, не отвечающие некоторым из этих критериев, отбрасываются (см. Рисунок 3). Температура отжига праймера рассчитывается по той же формуле, что и в Primer3 (согласно [25]), для достижения результатов, сравнимых с результатами метода на основе Primer3:

    Генерируется большое количество кандидатов, которые затем проверяются на уникальность, как описано выше. Если найден уникальный праймер, он возвращается как результат. Если это невозможно, возвращается праймер с наименьшим количеством совпадений среди всех исследованных праймеров.


    PrimerCE: разработка праймеров для клонирования и экспрессии генов

    Для различных приложений был разработан ряд программ дизайна праймеров. Однако ни одна из этих программ не может быть использована для создания праймеров для клонирования генов, направленных на экспрессию белка. Здесь мы сообщаем о дизайне PrimerCE, который можно использовать для охвата всего процесса клонирования и экспрессии генов. Основные функции PrimerCE включают проверку последовательности распознавания рестрикционного фермента, проверку открытой рамки считывания, проверку стоп-кодона, корректировку основания, оптимизацию праймера, сборку последовательности и анализ белка. В дополнение к этому, программа может быть изменена в зависимости от различных потребностей пользователей, например можно интегрировать новую векторную последовательность и последовательности узнавания рестрикционного фермента. С помощью PrimerCE можно создать пару праймеров за считанные минуты. Программа доказала свою эффективность при разработке праймеров в наших высокопроизводительных экспериментах по клонированию и экспрессии генов. Программное обеспечение находится в свободном доступе по адресу http://tch.hebau.edu.cn/shengm/download/down.html.

    Это предварительный просмотр содержимого подписки, доступ через ваше учреждение.


    Оптимизация дизайна грунтовки?

    Hallo Community, на данный момент у меня есть задача разработать несколько праймеров для диагностического метода, поэтому требования немного сложнее, чем в противном случае:

    Нужно флангировать точечную мутацию (да)

    создать продукт ПЦР прибл. 200-600 п.н. (секвенирование по Сэнгеру)

    Необходимо быть высокоспецифичным (да) - проблема, похоже, в том, что фланкирующие последовательности более или менее законсервированы на других генах и хромосомах. Я работаю на canis fam. (Собаки), и поскольку это диагностический материал, я хочу исключить вероятность того, что заражение человека может вызвать ложные продукты ПЦР.

    реакция ПЦР должна быть очень устойчивой! Так что никаких (или как можно меньше) вторичных структур, самоотжига или образования димеров праймера!

    Я несколько раз изменил свой рабочий процесс, надеясь, что на этот раз я нашел лучший способ, но это не так. А еще я пробовал разное программное обеспечение и т. Д.

    Мой последний рабочий процесс выглядит следующим образом: - Я загружаю свой файл gene.fasta в конструктор праймеров NCBI (Primer Blast) - Я выбираю размер продукта, геномы для взрыва (Canis fam. И Homo sapiens), размер праймера и т. Д. Взрывайте и получайте результаты. -Now I have a couple of primer pairs that I then check for unwanted binding (all of them look quite good)

    Here comes the unoptimized, inefficient part: -copy them either into an excel sheet (manually, cause I see no option to export, save or otherwise output the data) including some helpful info (length, Tm etc), or directly in OligoAnalyzer -I check for secondary structures and self annealing (bad) and mark the good ones -Then I try the different combinations of the „good“ primers and check for primer dimers.

    As you can see this is not very elegant and a lot of work and in the end I’m left with 1, maybe 2 suitable primer pairs.

    I hope there is an alternative and a better way to do this all, and that you may help me and point me in the right direction.


    The Li Lab

    MethPrimer is a program for designing bisulfite-conversion-based Methylation PCR Primers. Currently, it can design primers for two types of bisulfite PCR: 1) Methylation-Specific PCR (MSP) and 2) Bisulfite-Sequencing PCR (BSP) or Bisulfite-Restriction PCR. MethPrimer can also predict CpG islands in DNA sequences

    Input Sequence: A DNA sequences in any format. No editing is required before input.>

    Выход: MethPrimer returns results in both text and graphic view including results of primer picking and CpG island prediction.

    How to cite MethPrimer: Li LC and Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 2002 Nov18(11):1427-31. PMID: 12424112.

    MethPrimer has been cited over 1900 times as of June 2019 according to Google Scholar. Click here to see who has used the MethPrimer program.

    Submit your paper to Journal of Biological Methods (ISSN 2326-9901) - an open access journal


    Detection of Macrophomina phaseolina, M. pseudophaseolina а также M. euphorbiicola using the primer sets MpCalF/MpCalR, MsCalF/MsCalR and MeCalF/MeCalR, respectively. Lane M: DNA marker lanes 2 to 6: M. phaseolina (MP) isolates CMM-2748, CMM-3540, CMM-3615, CMM-4048 and CMM-4149, respectively lanes 7 to 11: M. pseudophaseolina (MS) isolates CMM-4029, CMM-4131, CMM-4155, CMM-4161, CMM-4231, respectively lanes 12 to 16: M. euphorbiicola (ME) isolates CMM-2158, CMM-2718, CMM-4045, CMM-4134 and CMM-4145, respectively (PNG 938 kb)

    Detection of Macrophomina phaseolina, M. pseudophaseolina а также M. euphorbiicola using the primer sets MpTefF/MpTefR, MsTefF/MsTefR and MeTefF/MeTefR, respectively. Lane M: DNA marker lanes 2 to 6: M. phaseolina (MP) isolates CMM-2748, CMM-3540, CMM-3615, CMM-4048 and CMM-4149, respectively lanes 7 to 11: M. pseudophaseolina (MS) isolates CMM-4029, CMM-4131, CMM-4155, CMM-4161, CMM-4231, respectively lanes 12 to 16: M. euphorbiicola (ME) isolates CMM-2158, CMM-2718, CMM-4045, CMM-4134 and CMM-4145, respectively (PNG 454 kb)

    Evaluation of the specificity of the primer sets MpTefF/MpTefR, MsTefF/MsTefR and MeTefF/MeTefR in PCR assays using forty-two fungal isolates of the different genera (negative control). Lanes 1 to 42 Isolates in Table S3. Mp: M. phaseolina Ms.: M. pseudophoseolina Me: M. euphorbiicola (PNG 435 kb)


    Смотреть видео: Designing a primer using ApE tool (August 2022).