Информация

Отбор линий в эволюции плазмид

Отбор линий в эволюции плазмид


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я читал Полссона (2002), и я не уверен, что он имеет в виду под «выбором линии передачи» во втором и последнем разделе. Статья посвящена репликации плазмид и в основном концентрируется на противоположных давлениях двух уровней отбора:

  1. выбор внутри ячейки - конкуренция между плазмидами в одной клетке. Плазмида может подвергаться цис-мутации и избыточной репликации, что приводит к более высокой внутриклеточной приспособленности, чем фокальная плазмида. Плазмиды воспроизводятся.
  2. выбор между ячейками - конкуренция между клетками. Клеткам с более высокой нагрузкой плазмид потребуется больше времени для воспроизведения, а плазмиды, которые производят большую нагрузку, будут иметь более низкую межклеточную приспособленность. Клетки, содержащие плазмиды, воспроизводятся.

В контексте, что означает третий уровень отбора - отбор по происхождению? Что воспроизводит? Как родословные разделяются или взаимодействуют?

Мое предположение

Означает ли селекционный отбор просто групповой отбор отдельных колоний клеток? В таком случае, как формируются новые родословные? Я ожидал бы, что на этом уровне группы будут выбраны нулевые уровни плазмид (поскольку они не нагружают клетки и, таким образом, эти группы клеток будут расти быстрее всего), но Паулссон (2002) предполагает обратное:

Отбор клонов может благоприятствовать плазмидным признакам, которые помогают популяции плазмидсодержащих клеток бороться с клетками, свободными от плазмиды.

Есть ли более подробное обсуждение этого вопроса, чем один раздел в Paulsson (2002)? Ни единицы отбора, ни статьи Википедии об эволюции или генетике не отвечают на мой вопрос. В первом упоминается происхождение только мимоходом, а во вторых двух не обсуждаются модели отбора.


Использованная литература

Паулссон, Дж. (2002). Многоуровневый отбор по репликации плазмиды. Генетика, 161(4): 1373-1384.


Он определяет селекцию клонов как отбор по признакам, которые увеличивают приспособленность группы плазмид, а не отдельной плазмиды в клетке или конкретной клетке, содержащей плазмиды. Он говорит, что единицей отбора являются «клады плазмид-хозяев»: другими словами, единицей отбора является группа близкородственных плазмид в отдельных клетках. Это пример родственного отбора, хотя я не встречал широко распространенной конкретной терминологии. Он, вероятно, не использует родственный отбор, потому что плазмиды не имеют четко определенного потомства, поэтому он использует более широкий термин для родства - родословная. Я мог бы предпочесть выбор клады, но у этого термина есть свой багаж. Я не уверен (как и Паулссон), что родственный отбор необходим для объяснения «злобно низких показателей потерь», поскольку и внутриклеточный, и межклеточный отбор благоприятствуют более низким показателям потерь.


Хромосомное штрих-кодирование Кишечная палочка популяций показывает динамику разнообразия родословных с высоким разрешением

Эволюционная динамика в больших бесполых популяциях находится под сильным влиянием множества конкурирующих полезных линий, большинство из которых разделяются с очень низкими частотами. Однако технические препятствия на пути отслеживания большого количества этих редких клонов в бактериальных популяциях до сих пор не позволяли детально выяснить эволюционную динамику. Здесь мы преодолеваем это препятствие, разрабатывая технику хромосомного штрих-кодирования, которая позволяет одновременно отслеживать примерно 450 000 различных клонов в кишечная палочка, который мы используем для проверки влияния субингибирующих концентраций обычных антибиотиков на эволюционную динамику низкочастотных клонов. Мы обнаружили, что популяции теряют разнообразие клонов с определенной скоростью, которая соответствует их режиму приема антибиотиков. Мы также выяснили, что судьбы некоторых клонов совпадают в независимых экспериментах. Анализируя динамику траектории, мы приписываем воспроизводимые судьбы этих клонов наличию ранее существовавших полезных мутаций и демонстрируем, как относительный вклад ранее существовавших и мутаций de novo варьируется в зависимости от схемы приема лекарств. Наконец, мы воспроизводим наблюдаемую динамику родословной с помощью моделирования. В целом, наши результаты представляют собой ценную методологию для изучения эволюции бактерий, а также понимание эволюции при субингибирующих уровнях антибиотиков.


Вступление

Плазмиды - это дополнительные генетические элементы, способные горизонтально переноситься между бактериями. Они несут гены, которые помогают хозяину адаптироваться к новым нишам и стрессам, играя ключевую роль в эволюции бактерий. 1 Плазмиды часто кодируют гены устойчивости к антибиотикам, отвечающие за распространение устойчивости к антибиотикам и множественной устойчивости среди патогенных бактерий, что в настоящее время является серьезной проблемой для общественного здравоохранения. 2,3

Один из центральных вопросов биологии плазмид - как плазмиды могут стабильно сохраняться в бактериальных популяциях в долгосрочной перспективе. 4 Это сложно понять из-за факторов, препятствующих выживанию плазмид. В частности, (i) плазмиды производят издержки для бактерий-хозяев 5, вызывая конкурентный недостаток, и (ii) плазмиды могут быть потеряны во время деления клеток (даже если это происходит с очень низкой скоростью). 6 Взятые вместе, эти два фактора предсказывают постоянное снижение частоты плазмид в популяции с течением времени. 7 Однако существуют факторы, которые противодействуют эффекту стоимости и сегрегационной потери и способствуют поддержанию плазмид в бактериальных популяциях, такие как (i) отбор по признакам, кодируемым плазмидой, (ii) горизонтальный перенос плазмиды между бактериями (в основном путем конъюгации). ) и (iii) компенсаторные мутации, снижающие стоимость, продуцируемую плазмидой. 4,8 Баланс между всеми этими факторами определяет судьбу данной плазмиды в бактериальной популяции. 9

Предыдущие теоретические исследования утверждали, что плазмиды могут поддерживаться в бактериальной популяции только тогда, когда они способны конъюгировать. 8,10,11 Однако недавние успехи в секвенировании генома показали, что, как это ни парадоксально, большая часть плазмид, по-видимому, является «нетрансмиссивной» путем конъюгации в соответствии с их последовательностью. 12 Механизмы, которые позволяют сохраняться нетрансмиссивным плазмидам, плохо изучены. В недавнем исследовании мы использовали математическое моделирование, функциональную геномику и экспериментальную эволюцию для исследования этой проблемы. 13 Мы разработали модельную систему на основе условно-патогенного микроорганизма. Синегнойная палочка PAO1 несет небольшую неконъюгативную плазмиду pNUK73, которая вызывает особенно большие затраты на приспособленность в этом штамме (снижение относительной приспособленности приблизительно на 20%). pNUK73 придает устойчивость к неомицину, вызывая увеличение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) примерно в 60 раз в PAO1. После 30 ежедневных пассажей (300 поколений) субпопуляция, несущая плазмиду, представила компенсаторные мутации, которые полностью компенсировали стоимость носительства плазмиды. Эти мутации предположительно инактивировали 3 конкретных хромосомных гена: геликазу, несущую UvrD-подобный C-концевой домен геликазы (PA1372), и две смежные предполагаемые серин / треониновые протеинкиназы (PA4673.15 и PA4673.16).

Однако субпопуляция, не содержащая плазмид, также приспосабливалась к условиям окружающей среды, и, следовательно, их приспособленность также увеличивалась по сравнению с родительским штаммом. Это было связано с приобретением в целом полезных мутаций для адаптации к лабораторным условиям. Эти мутации нацелены в первую очередь на ген дигуанилатциклазы. wspF (PA3703) в нашей экспериментальной системе. Таким образом, линия, несущая плазмиды, продолжала вымирать, хотя и более медленными темпами. В результате размер популяции линии, несущей плазмиду, был слишком мал для исправления обычно полезных мутаций. Однако популяции, несущие плазмиды, можно было спасти, добавив антибиотики. Это привело к увеличению размера популяции клеток, несущих плазмиды, что позволило исправить полезные мутации. Таким образом, мы обнаружили, что положительный отбор и компенсаторная адаптация взаимодействуют для стабилизации pNUK73: положительный отбор увеличивает вероятность компенсаторной адаптации за счет увеличения размера популяции клонов, несущих плазмиду, что повышает вероятность новых адаптивных мутаций в клетках, несущих плазмиду. Компенсаторная адаптация, в свою очередь, увеличивает влияние положительного отбора на стабильность плазмиды за счет снижения скорости потери плазмиды между эпизодами положительного отбора.

Наши предыдущие результаты показывают, что компенсация и положительный отбор помогают стабилизировать непередаваемые плазмиды на протяжении нескольких сотен поколений. Однако долгосрочное поддержание этих плазмид остается трудным для понимания. 13 В этом комментарии мы расширяем результаты нашей модели популяционной генетики, чтобы проанализировать эффекты различных режимов отбора, а также влияние горизонтального переноса генов на долгосрочную стабильность этих плазмид.


Полученные результаты

МОДЕЛЬ

Мы рассматриваем популяцию, состоящую из клеток, которые могут быть хромосомно-устойчивыми или хромосомно-чувствительными ( или ), без плазмиды, устойчивой плазмиды или чувствительной плазмиды (, , или ). Это дает шесть возможных типов клеток: , , , , , а также (первая буква обозначает хромосому, вторая буква плазмиду).

Начнем с разработки модели динамики этих ячеек (рис. 1) и обозначим плотность каждого типа ячеек как . Клетки размножаются со скоростью . Конкуренция между клетками отражается на уровне смертности, зависящей от плотности , куда - общая плотность клеток (). Плазмиды распространяются через зависящую от плотности передачу между клетками со скоростью и теряются во время репликации клеток с вероятностью (потеря сегрегации). Плазмидное носительство связано с расходами на фитнес , что снижает скорость репликации в разы . Мы предполагаем, что клетки могут быть инфицированы только одной плазмидой за раз. Клетки без сопротивления ( а также ) испытывают дополнительный уровень смертности от воздействия антибиотиков. Сопротивление связано со стоимостью приспособленности, что снижает скорость репликации в несколько раз. . Мы предполагаем, что гены устойчивости имеют одинаковую стоимость пригодности и одинаковую эффективность, независимо от того, являются ли они хромосомными или плазмидными. Клетки, которые обладают как хромосомной, так и плазмидной устойчивостью, испытывают двойную стоимость пригодности . Эффект от изменения этих предположений исследуется во вспомогательной информации (раздел 2). Наши основные результаты в целом надежны, а чувствительность выделена в основном тексте.

Схема моделируемой динамики (ур. 1). Каждый серый кружок представляет тип клетки, а внутренние кружки представляют хромосому (большая) и плазмида (маленькая), причем обозначая сопротивление и чувствительность. Стрелками показаны смоделированные процессы: репликация клеток (темно-синий), гибель (фиолетовый), передача плазмиды (оранжевый) и потеря сегрегации (голубой). Этикетки указывают скорость, с которой происходят эти процессы. указывает плотность типа ячейки, поэтому - общая плотность клеток (), - общая плотность клеток с устойчивой плазмидой (), а также - общая плотность клеток с чувствительной плазмидой (). скорость репликации коэффициент смертности, зависящий от плотности смертность, связанная с антибиотиками скорость передачи плазмиды вероятность потери сегрегации стоимость носительства плазмиды и стоимость ношения гена устойчивости. (1)

Параметры модели приведены в таблице 1. Мы ожидаем, что значения параметров (т.е. ставки и затраты) будут значительно различаться, например, в зависимости от вида бактерий, типа плазмиды, антибиотика и окружающей среды. Наша цель - качественно понять поведение обобщенной системы, а не делать количественные прогнозы относительно конкретной системы. Поэтому мы исследуем широкий диапазон значений параметров (раздел вспомогательной информации 1), а не выбираем параметры, отражающие конкретную систему.

Параметр Определение Габаритные размеры Основное текстовое значение (диапазон СИ) Бистабильность при
Скорость репликации Время −1 1 (0.5, 2) Высокий
Смертность Ячейки объема −1 раз −1 1 (0.5, 2) Низкий
Смертность, связанная с антибиотиками Время −1 1 (0, 2) Низкий
Стоимость устойчивости к антибиотикам Безразмерный 0.05 (0, 0.5) Высокий
Стоимость носительства плазмиды Безразмерный 0.075 (0, 0.5) Низкий
Скорость передачи плазмиды Ячейки объема −1 раз −1 0.2 (0, 0.25) Высокий
Потеря сегрегации Безразмерный 0.005 (0, 0.1) Низкий
  • Примечание: Более конкретно, пятая колонка указывает, существует ли область бистабильности (где устойчивость может быть плазмидной или хромосомной) при высоких или низких значениях параметров по сравнению с областью, где только хромосомная устойчивость является эволюционно стабильной (см. Раздел вспомогательной информации 1) . Единицы измерения параметров произвольные. Основные текстовые значения выбраны, чтобы лучше всего проиллюстрировать диапазон эволюционно стабильных результатов.

ЭВОЛЮЦИОННАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ ПЛАЗМИДНОЙ И ХРОМОСОМНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

Нас интересует эволюционная стабильность хромосомной и плазмидной устойчивости, то есть, может ли установленная хромосомная устойчивость быть заменена плазмидной устойчивостью и наоборот. Мы определяем области параметров, в которых каждый тип сопротивления является стабильным (рис. 2, а также S1 и S2), используя линейный анализ устойчивости (см. Методы). В условиях отбора устойчивости мы наблюдаем три поведения: эволюционная стабильность хромосомной, но не связанной с плазмидой устойчивости, эволюционная стабильность плазмидной, но не хромосомной устойчивости и эволюционная стабильность обеих форм устойчивости. В этой третьей области резистентность возникает либо на плазмиде, либо на хромосоме, но не на обоих сразу: наличие как хромосомной, так и связанной с плазмидой устойчивости увеличивает стоимость устойчивости, но не дает дополнительных преимуществ.

Эволюционная стабильность плазмидной и хромосомной устойчивости. Цвета показывают, какая форма устойчивости является эволюционно стабильной: только хромосомная устойчивость (оранжевый), только плазмидная устойчивость (синий) или любая из них (фиолетовый). Когда устойчивость является хромосомной, чувствительная плазмида может либо присутствовать, либо отсутствовать в популяции (темный против светло-оранжевого). В белом пространстве на левой панели ни одна из форм устойчивости не является стабильной (популяция чувствительна к антибиотикам). Значения параметров: , , . Для левой панели = 0,075 и . Для правой панели а также . На рисунках S1 и S2 показаны результаты для других параметризаций. Обратите внимание, что в пространстве параметров, где сопротивление полезно, оно может быть существенным (: чувствительные к антибиотикам клетки нежизнеспособны, даже в отсутствие конкуренции со стороны резистентных клеток) или несущественны. Это различие не влияет на наши результаты (рис. S1 и S2).

Только хромосомная резистентность

Когда эволюционно стабильна только хромосомная устойчивость, гены устойчивости всегда оказываются на хромосоме в течение эволюционного периода времени. Плазмида будет либо чувствительной, либо отсутствовать в популяции. В общих чертах (таблица 1 и рисунки S1 и S2) хромосомная устойчивость является единственным эволюционно стабильным результатом, когда польза от устойчивости высока (высокая смертность, связанная с антибиотиками, низкая стоимость устойчивости), когда приспособленность плазмиды низкая (низкая скорость передачи плазмиды, высокая потеря сегрегации, высокая стоимость плазмиды) и когда общая плотность клеток низкая (высокая скорость гибели, низкая скорость репликации).

Только плазмидная устойчивость

Когда устойчивость, передаваемая плазмидой, эволюционно стабильна, гены устойчивости всегда будут попадать в плазмиду. Обратите внимание, что в этой области хромосомная устойчивость вообще нестабильна (рис. S12): она представляет собой область, в которой гены устойчивости могут сохраняться только при горизонтальном переносе (van Dijk et al. 2020). Этот результат возникает только при очень специфических условиях (небольшое пространство параметров, когда сопротивление дает лишь незначительное улучшение пригодности, рис. 2), и его присутствие зависит от структуры модели (например, как моделируется эффект антибиотика, см. Рис. S7). Поэтому мы не считаем это экологически правдоподобным объяснением того, почему гены устойчивости находятся на плазмидах.

Бистабильность

Когда оба равновесия эволюционно стабильны, устойчивость может быть хромосомной или плазмидной, в зависимости от начальных условий. Как только одна форма сопротивления установилась, она больше не может быть вытеснена другой.

Для дальнейшего исследования зависимости от начальных условий мы численно моделируем систему, начиная с различных начальных плотностей ячеек (см. Методы). Мы рассматриваем сценарий с начальной популяцией, состоящей из устойчивых клеток и чувствительных клеток (рис. 3). Мы варьируем (i) начальную частоту чувствительной плазмиды в чувствительной популяции (ii) исходную частоту хромосомной устойчивости по сравнению с плазмидной резистентностью в резистентной популяции и (iii) несут ли хромосомно-устойчивые клетки чувствительную плазмиду. Результаты этого моделирования (рис. 3 и S3 и S4) дают представление об эволюционных давлениях, которые определяют расположение генов устойчивости тремя способами.

Влияние начальных условий на равновесное расположение гена устойчивости, показывающее эволюционный результат, зависит как от начальных частот плазмидной и хромосомной устойчивости, так и от начальной частоты чувствительной плазмиды. На левых панелях показаны вариации начальных условий. Правые панели показывают, наблюдается ли в равновесии плазмидная (синий) или хромосомная (оранжевый) устойчивость. В Икс-axis указывает частоту чувствительной плазмиды в исходной чувствительной популяции . В у-axis указывает частоту передаваемой плазмидой резистентности в исходной резистентной популяции. для панели А, для панели B. Переносимая плазмидами устойчивость является более типичным результатом для панелей B, чем для панели A, из-за присутствия чувствительной плазмиды в исходной хромосомно-устойчивой популяции на панели A. Общие плотности исходной чувствительной и устойчивой популяций равны 1. (Изменение начального отношения сопротивления к чувствительности не влияет на качественные результаты - Рис. S3). Значения параметров следующие: , , , = 0.075, , , а также .

Во-первых, наличие положительного частотно-зависимого отбора: резистентность, передаваемая плазмидами, является более типичным результатом, когда исходная частота резистентности, передаваемой плазмидами, высока по сравнению с частотой хромосомной резистентности. Точно так же высокая начальная частота хромосомной устойчивости по сравнению с резистентностью, передаваемой плазмидами, приводит к хромосомной устойчивости как эволюционному результату. Таким образом, пригодность одного типа сопротивления положительно коррелирует с его частотой. Эта частотная зависимость возникает из-за того, что клетки с двойной устойчивостью менее приспособлены, чем клетки с любой формой одиночного сопротивления: двойное сопротивление влечет за собой дополнительные затраты на приспособленность, но не дает дополнительных преимуществ приспособленности.Чем выше частота хромосомной устойчивости, тем выше вероятность того, что устойчивая плазмида заразит хромосомно-устойчивую (а не хромосомно-чувствительную) клетку. Это ставит в невыгодное положение устойчивую плазмиду. Точно так же, чем выше частота резистентной плазмиды, тем выше вероятность того, что хромосомно-резистентная клетка будет инфицирована резистентной плазмидой. Это ставит в невыгодное положение устойчивую хромосому. Таким образом, чем более распространена форма сопротивления, тем больше она пригодна по сравнению с другой формой.

Во-вторых, эволюционный результат также зависит от частоты появления чувствительной плазмиды. Плазмидная устойчивость выигрывает от того, что чувствительная плазмида встречается редко: плазмидная резистентность является более типичным результатом, когда исходная хромосомно-резистентная популяция не несет чувствительную плазмиду и когда частота плазмиды в чувствительной популяции низкая. Это связано с тем, что низкая начальная частота чувствительной плазмиды означает, что переносимая плазмидами устойчивость может распространяться как по вертикали (репликация клеток), так и по горизонтали (передача плазмиды), что позволяет ей увеличиваться по частоте быстрее, чем хромосомная устойчивость.

В-третьих, в целом хромосомная резистентность является более типичным результатом этих симуляций, чем резистентность, переносимая плазмидами. Это связано с тем, что резистентность, передаваемая плазмидами, в отличие от хромосомной устойчивости, подвержена потере сегрегации: она не всегда наследуется во время репликации клеток. Действительно, увеличение вероятности потери сегрегации способствует хромосомной устойчивости (рис. S4).

НАДЕЖНОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ

Мы проверяем устойчивость этих результатов к ряду предположений о структуре модели (см. Раздел «Методы и вспомогательная информация»). Общий результат состоит в том, что наличие бистабильности является устойчивым, хотя размер области бистабильности может изменяться. Единственное важное предположение для положительной частотной зависимости состоит в том, что двойное сопротивление менее выгодно, чем одиночное сопротивление (рис. S5 и S6). Другими словами, устранение дополнительных затрат от двойного сопротивления или увеличение преимущества двойного сопротивления настолько, что оно перевешивает эти дополнительные затраты, устраняет область бистабильности. В этих условиях преобладает двойная устойчивость (т.е. популяция будет состоять из устойчивой плазмиды, циркулирующей в хромосомно устойчивой популяции).

Особого внимания заслуживают результаты двух анализов чувствительности. Во-первых, наши результаты устойчивы к включению потока генов между плазмидой и хромосомой (например, транспозиция гена устойчивости). Поток генов позволяет исключенной в противном случае форме устойчивости сохраняться с низкой частотой (аналогично балансу мутации-отбор) и увеличивает диапазон начальных условий, ведущих к хромосомной устойчивости (рис. S8). Однако эти эффекты становятся существенными только при нереалистично высоких скоростях транспозиции (вспомогательная информация, раздел 2.4) (Sousa et al. 2013). Во-вторых, наличие бистабильности устойчиво к моделированию колеблющегося, а не постоянного давления антибиотиков. В зависимости от периода флуктуация может способствовать устойчивости, передаваемой плазмидами, увеличивая размер пространства параметров, в котором эволюционно стабильна только устойчивость, передаваемая плазмидами (Рис. S10).

СВЯЗЬ С ПРЕДЫДУЩИМИ РЕЗУЛЬТАТАМИ МОДЕЛИРОВАНИЯ

Затем мы вернемся к некоторым предыдущим результатам моделирования. Как обсуждалось во введении, предыдущее моделирование предсказывает, что локально полезные признаки будут передаваться из плазмид, а не из хромосом, таким образом обеспечивая дополнительную гипотезу о том, почему определенные гены находятся на плазмидах (Bergstrom et al. 2000). Однако модель, на основе которой это предсказание, предполагает отсутствие плазмиды вне локальной ниши. Поэтому мы спрашиваем, благоприятствует ли локальная адаптация переносимой плазмидой резистентности, если чувствительная плазмида может сохраняться вне локальной ниши. Мы модифицируем нашу модель, чтобы включить приток чувствительных клеток, и варьировать частоту чувствительной плазмиды в этих поступающих клетках (раздел вспомогательной информации 3). Это соответствует сценарию, в котором сопротивление выгодно локально в смоделированной среде, но не выбрано для других мест. Как показано на фиг. 4, приток чувствительных клеток без чувствительной плазмиды действительно способствует переносимой плазмидой резистентности, как предполагалось ранее (Bergstrom et al. 2000). Однако приток чувствительных клеток с чувствительной плазмидой способствует хромосомной устойчивости. Сила этого эффекта зависит от скорости притока чувствительных клеток. Таким образом, локальная адаптация способствует устойчивости, передаваемой плазмидами, только если частота чувствительной плазмиды невысока за пределами локальной ниши.

Местоположение (хромосомный или плазмидный) локально полезного гена устойчивости зависит от присутствия чувствительной плазмиды в иммигрантных клетках. Первоначальная популяция является полностью устойчивой (с хромосомно-устойчивыми клетками, несущими чувствительную плазмиду, что соответствует панели A на рисунке 3), с у- ось, указывающая частоту передаваемой плазмидой резистентности в этой исходной популяции . В Икс-axis указывает частоту появления чувствительной плазмиды в иммигрантных клетках. Присутствие плазмиды в этих иммигрантных клетках способствует хромосомной устойчивости. Высокая скорость притока составляет , низкий приток . Значения других параметров: , , , = 0.075, , , а также .

Во-вторых, мы пересмотрим результаты, касающиеся персистенции плазмид. Предыдущие работы по моделированию показали, что если приспособленность плазмиды слишком низкая для того, чтобы плазмиды могли существовать как чистые паразиты (т. Е. Без генов, полезных для клетки-хозяина), полезные гены всегда будут располагаться на хромосоме, а не в плазмиде (в отсутствие локальной адаптации Бергстром и др. 2000). Таким образом, сохранение плазмид с низкой трансмиссивностью является парадоксом: они не могут поддерживаться без полезных генов, но полезные гены не могут поддерживаться на этих плазмидах (Bergstrom et al. 2000).

Мы проверяем это предсказание на нашей модели (как подробно описано в разделе 4 вспомогательной информации), сравнивая пространство параметров, в котором устойчивость, передаваемая плазмидами, является эволюционно стабильной (т. Е. Гены устойчивости могут располагаться на плазмиде даже при наличии конкуренции со стороны хромосомной устойчивости). с пространством параметров, в котором может существовать паразитическая плазмида (т. е. чувствительная плазмида может сохраняться в хромосомно-чувствительной популяции). Мы обнаружили, что предыдущие результаты не подходят для представленной здесь модельной структуры: гены устойчивости могут располагаться на плазмиде, а не на хромосоме, даже если трансмиссионная способность плазмиды слишком мала для того, чтобы плазмида могла существовать как паразит (рис. S11). Это означает, что теоретически возможны плазмиды с низкой трансмиссивностью, которые сохраняются исключительно из-за того преимущества, которое они обеспечивают клеткам-хозяевам. Однако стоит отметить, что пространство параметров, в котором это происходит, невелико (рис. S11).

СКОРОСТЬ ПРИОБРЕТЕНИЯ ОПРЕДЕЛЯЕТ РАСПОЛОЖЕНИЕ ГЕНА СОПРОТИВЛЕНИЯ

На данный момент наши результаты показывают, что для умеренно полезных генов (то есть тех, которые находятся в области бистабильных параметров) наличие положительного частотно-зависимого отбора означает, что плазмидная устойчивость может быть эволюционно стабильной, несмотря на потерю сегрегации. Этот частотно-зависимый отбор сам по себе не является достаточным объяснением того, почему гены устойчивости передаются из плазмид. Однако это предполагает, что какая бы форма устойчивости (плазмидная или хромосомная) ни была приобретена первой, скорее всего, установится в популяции: если первая форма устойчивости успевает увеличиться в плотности до приобретения другой формы, ее более высокая частота даст ему преимущество в фитнесе. Первый тип сопротивления не обязательно должен достигать фиксации, чтобы предотвратить вторжение другого: частотно-зависимое преимущество достаточно велико даже при низких частотах общего сопротивления (рис. S13). Следовательно, когда скорость приобретения сопротивления низка по сравнению со скоростью увеличения частоты сопротивления однажды приобретенного, первая форма сопротивления будет сохраняться.

Таким образом, присутствие генов устойчивости на плазмидах можно объяснить тем, что скорость приобретения резистентности, переносимой плазмидами, выше, чем скорость приобретения хромосомной устойчивости. Действительно, скорость переноса конъюгированной плазмиды обычно выше, чем скорость горизонтального переноса хромосомных генов (одна оценка, основанная на сравнении экспериментальных показателей, предполагает порядок выше, хотя это, вероятно, сильно зависит от контекста. Nazarian et al. 2018). Кроме того, для ряда видов бактерий основным механизмом приобретения гена устойчивости действительно считается межвидовая передача несущих устойчивость плазмид (Baker et al., 2018 MacLean и San Millan, 2019).

Чтобы формализовать эту идею, мы разработали простую модель приобретения устойчивости у нескольких видов (рис. 5 и раздел «Методы»). Мы моделируем разновидности ген устойчивости, который полезен для всех видов, и плазмида, которая может передаваться между всеми видами и сохраняться у них (либо потому, что у нее широкий диапазон хозяев, либо потому, что ее диапазон может быть смещен или расширен после переноса Loftie-Eaton et al.2016 ). Устойчивость может быть плазмидной или хромосомной. Как только вид приобретает одну из форм устойчивости, эта форма устойчивости устанавливается и больше не может быть заменена (из-за положительного частотно-зависимого отбора). Мы предполагаем, что гены устойчивости появляются на хромосоме только de novo (со скоростью ). Ген может распространяться посредством межвидовой горизонтальной передачи хромосомной устойчивости (например, трансформации) (со скоростью ) или межвидовой перенос плазмид устойчивости (со скоростью ). Мы предполагаем, что ген может перемещаться между плазмидой и хромосомой с низкой скоростью, что позволяет исключенной в противном случае форме устойчивости сохраняться с низкой частотой. Мы не моделируем это сосуществование явно, но моделируем горизонтальный перенос низкочастотной формы (со скоростью для плазмидной устойчивости и скорости на хромосомную устойчивость, где - частота низкочастотной формы).

Распространенность резистентности, передаваемой плазмидами. Панель A: Представление структуры модели. представляет виды без гена устойчивости виды с геном устойчивости на плазмиде виды с геном устойчивости на хромосоме. скорость, с которой возникает сопротивление в результате мутации скорость, с которой переносимая плазмидами устойчивость передается между видами скорость, с которой хромосомная устойчивость передается между видами и захватывает поток генов между плазмидой и хромосомой. Панель B: доля резистентности, передаваемой плазмидами, зависит от количества смоделированных видов и соотношения скорости межвидового переноса хромосомных () и плазмидный ген (). Горизонтальные пунктирные линии показывают максимальную долю устойчивости плазмиды, учитывая, что устойчивость должна сначала появиться на хромосоме (). Планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы на основе 1000 реализаций. Параметры были: , а также . Результаты для альтернативной параметризации показаны на рисунке S14.

Мы моделируем эту систему стохастически (см. Раздел «Методы»), начиная с ни одного вида, имеющего ген устойчивости. На рисунке 5 показана доля видов с плазмидной устойчивостью после того, как ген распространился на все виды. Как и ожидалось, доля видов с плазмидной устойчивостью увеличивается с увеличением скорости межвидового переноса плазмиды. Кроме того, эта пропорция также увеличивается с увеличением количества смоделированных видов. Этот эффект возникает по двум причинам. Во-первых, первоначальное появление гена de novo должно происходить на хромосоме. Таким образом, например, когда моделируются только два вида, плазмидная резистентность может возникать только у одного из двух видов. Во-вторых, влияние скорости межвидового переноса возрастает с увеличением числа потенциальных видов-доноров. Эти результаты устойчивы к различной параметризации (рис. S14).


Эволюция бактериальных плазмид и уровни отбора

Поток генов между различными репродуктивными организмами, такими как бактериальные плазмиды и хромосомы, представляет необычные проблемы для эволюционного анализа. Намного больше, чем у эукариот, репродуктивные преимущества на нескольких уровнях селекции - генах, транспозонах, плазмидах, клетках и клонах - необходимо учитывать одновременно, чтобы понять эволюцию плазмид. В конфликтных ситуациях постоянно не преобладает какой-либо уровень, и некоторые репродуктивные единицы несут гены, которые ограничивают их собственное воспроизводство или выживание, очевидно, для улучшения воспроизводства или выживания репродуктивных единиц более высокого уровня, которые их несут. Несмотря на поток генов между плазмидами и хромосомами, гены для определенных функций проявляют сильную тенденцию к появлению на плазмидах, в то время как другие постоянно встречаются на хромосомах. Функции, обычно связанные с плазмидами, разнообразны, но все они полезны только в локально ограниченных контекстах. Утверждается, что за этот паттерн ответственны селективные последствия большей горизонтальной (внутри поколения) передачи плазмид. Тенденция прокариотных транспозонов, которые также являются горизонтально мобильными, нести гены, подобные тем, которые обычно присутствуют в плазмидах, подтверждает этот аргумент. Очевидная тенденция в плазмидах и транспозонах эукариот лишаться этих же признаков также согласуется с предсказаниями гипотезы локальной адаптации, потому что гены этих генетических единиц, как правило, не более подвижны по горизонтали, чем хромосомные гены. Есть теоретические причины ожидать, что плазмидные гены имеют тенденцию эволюционировать быстрее, чем хромосональные гены.


Полученные результаты

Наличие характерных номеров копий

Мы начинаем с сосредоточения нашего внимания на одной клетке, содержащей популяцию плазмид, идентичных по профилю репликации. Мы изначально игнорируем стохастический характер репликации и деления клеток и считаем количество копий непрерывной переменной, причем как рост хозяина, так и количество копий описываются детерминированными дифференциальными уравнениями (см. Уравнения 1 и 2 в дополнительном тексте S1). Наша модель позволяет установить связь между количеством плазмид в начале клеточного цикла () и количество плазмид в конце клеточного цикла во время деления клетки (), куда представляет количество плазмид в полученных дочерних клетках, предполагая равнораспределение во время деления клеток. Рисунок 2 демонстрирует типичную взаимосвязь между а также , которая зависит от скорости репликации плазмиды, которая, в свою очередь, является функцией параметров плазмиды , а также (см. уравнение 2). В зависимости от исходного количества плазмид в родительской клетке. , в образовавшихся дочерних клетках будет либо меньше (), более () или столько же плазмид (), поскольку изначально содержалась их родительская ячейка. Последний случай представляет собой равновесие между поколениями конкретного числа копий для данного набора значений параметров плазмиды. Это равновесие может быть стабильным или нестабильным, в зависимости от реакции системы на колебания количества копий. Условия устойчивого равновесия при наличии стабильный характеристический номер копии можно определить по:

так что когда в ячейке меньше чем плазмиды в начале клеточного цикла, плазмиды чрезмерно реплицируются, и когда у них больше, чем плазмиды, плазмиды не реплицируются. В обоих случаях, которые могут возникать в результате стохастичности репликации или сегрегации плазмид при делении клеток, наблюдается тенденция к равновесному будущему клеточному циклу с снова плазмиды. Примером стабильного характеристического количества копий является точка, отмеченная закрашенным кружком на рисунке 2. Точка, отмеченная открытым кружком на той же кривой, представляет собой нестабильное равновесное число копий, любое нарушение которого приведет либо к избыточной репликации плазмиды, либо к недостаточной репликации, причем последний случай в данном случае приводит к движению к стабильному равновесию.

Каждая кривая представляет детерминированное соотношение между количеством плазмид. в начале родительского клеточного цикла и количество плазмид в начале цикла дочерних клеток (при условии равнораспределения во время деления клеток) для диапазона начальных чисел копий и фиксированный набор параметров клеток и плазмид. Диагональ представляет собой согласованность количества копий между родительскими и дочерними клетками; точки под диагональю указывают на недостаточную репликацию плазмиды, а точки над диагональю указывают на избыточную репликацию плазмиды. Форма кривой и ее точка (точки) пересечения с диагональю зависят от значений параметров плазмиды, кривые, которые не пересекаются с диагональю, представляют собой случай последовательной недостаточной или избыточной репликации плазмид для любого начального числа копий (синий низкий кривая и голубой высокий кривой соответственно). Верхний конец каждой кривой соответствует пределу, за которым клетка не может поддерживать свою плазмидную популяцию из-за отрицательной скорости роста клеток, которая приводит к гибели клеток. Точки, отмеченные кружками на носителе Кривая (зеленая) представляет собой равновесные числа копий, закрашенный кружок указывает на стабильность и наличие характерного количества копий, тогда как белый кружок указывает на нестабильное равновесие. Критический кривая (красная), касательная к диагонали, представляет предел (край) устойчивости, при котором стабильные и нестабильные характеристические числа копий схлопываются до особой точки.

Границы стабильности плазмид.

Для любой конфигурации параметров репликации плазмиды , а также , мы можем определить, существует ли стабильное характеристическое количество копий, каково его значение и какова соответствующая пригодность ячейки, которая определяется как величина, обратная времени требуется для деления клетки. На рисунке 3 представлены результаты исследования пространства параметров плазмиды для двух различных режимов ЧПУ. Во-первых, мы рассматриваем случай, когда плазмиды обладают самоопределяемой скоростью репликации независимо от присутствия других плазмид в том же хозяине (, НО-ЧПУ). В этом случае единственным механизмом контроля количества копий является самоограничение плазмиды (в виде ), то, что ранние теоретические подходы называлось & # x0201cpassive & # x0201d контролем количества копий [36]. Во-вторых, мы рассматриваем случай активной петли отрицательной обратной связи между числом копий и скоростью репликации плазмиды, которая реализуется за счет синтеза транс-действующих ингибиторов репликации (, с участием , ЧПУ).

Стабильные (сплошные) и нестабильные (пунктирные) числа экземпляров равновесия для отдельной клетки в зависимости от скорости репликации базальной плазмиды для и различные значения сродства связывания (синий для зеленый для красный для ).Значения приспособленности клеток (рассчитанные как обратная величина времени деления клетки ), которые соответствуют стабильным характеристическим номерам копий, показаны на нижней панели. Стабильное и нестабильное равновесное число копий схлопывается до особой точки (край стабильности числа копий, что демонстрируется критическим кривая на рисунке 2), которая отмечена цветной вертикальной пунктирной линией, за которой не существует характерных чисел копий, то есть плазмиды сверхреплицируются для любого начального числа копий. Предел, ниже которого стабильное характеристическое количество копий становится равным нулю . В случае, когда (синие линии) край устойчивости совпадает с максимальной пригодностью клетки для (зеленые, красные линии) пик пригодности хоста окружен субоптимальными конфигурациями параметров, которые характеризуются стабильностью по отношению к количеству копий.

В первом случае (NO-CNC) мы наблюдаем, что система имеет стабильное ненулевое характеристическое число копий для чрезвычайно ограниченной области базальных скоростей репликации плазмид. . Эта стабильная область окружена областями нестабильности плазмиды, характеризующимися устойчивой недостаточной или избыточной репликацией плазмид для любого начального числа копий (описывается низким и высоким кривые на рисунке 2). В области стабильности плазмиды приспособленность клеток увеличивается с увеличением до критической точки, которая отмечает переход к нестабильности, когда плазмиды постоянно реплицируются. Следовательно, без ЧПУ межклеточный отбор будет способствовать увеличению значений скорости репликации плазмиды (), поскольку это приводит к более высокой приспособленности клеток, пока не будет достигнута критическая точка нестабильности плазмиды. Этот переход (обозначен вертикальной пунктирной линией на рисунке 3) происходит при максимальной пригодности клетки и характеризуется коллапсом стабильного и нестабильного равновесного числа копий до единственного числа копий. (событие, зафиксированное критическим кривая на рисунке 2). Постоянная избыточная репликация приводит к будущим клеточным циклам с увеличением количества плазмид, что в конечном итоге приводит к взрыву плазмиды и гибели клеток. Активация системы ЧПУ (, с участием ) эффективно расширяет диапазон стабильности плазмиды и, что особенно важно, отделяет точку перехода к нестабильности от точки оптимального роста клеток. В результате конфигурация параметров репликации плазмиды, обеспечивающая оптимальный рост клеток, теперь окружена субоптимальными, но также стабильными областями. В этих условиях межклеточный отбор для увеличения скорости деления клеток будет отдавать предпочтение клеткам, содержащим плазмиды со стабильным числом копий.

Стабильность плазмиды и рост хозяев

Наше предыдущее моделирование продемонстрировало, что, когда стохастичность игнорируется, существует только ограниченный диапазон значений. что обеспечивает стабильность репликации плазмиды. В отсутствие ЧПУ оптимизация скорости деления клеток привела бы к скоростям репликации плазмид на грани стабильности, тогда как присутствие ЧПУ расширяет диапазон стабильных скоростей репликации, а также создает ситуацию, в которой оптимальная клеточная пригодность расположен внутри этой области стабильности. Теперь мы продолжаем расширять детерминированную одноклеточную структуру, которую мы рассматривали до сих пор, чтобы исследовать стабильность плазмид и производительность хозяина в контексте стохастического многоклеточного моделирования, которое описывает асинхронный рост и деление (или смерть) хозяев и автономную репликацию плазмид внутри такие хозяева. Мы вводим стохастичность в репликацию плазмиды, считая ожидаемое количество событий репликации для плазмид в каждом хозяине в каждый дискретный момент времени как распределенное по Пуассону, как указано в уравнении 2 (для более подробной информации см. Дополнительный текст S1).

Эффективность конкретного штамма в таком стохастическом моделировании, в котором хозяева инфицированы плазмидами с идентичными значениями параметров репликации, можно оценить, вычислив среднюю чистую скорость роста хозяина как разницу между средним делением хозяев и коэффициентами смертности. На рисунке 4 показан результирующий ландшафт пригодности независимых штаммов в зависимости от соответствующих значений параметров репликации плазмиды. а также данный . Отметим, что из-за однородности популяции плазмид параметры а также взаимозаменяемы (см. также уравнение 2) и, как таковые, фитнес-ландшафт а также данный идентичен фитнес-ландшафту а также данный . В области стабильности плазмиды в этом ландшафте доминирует градиент чистой скорости роста хозяина, ведущий к области оптимального роста, в которой подчинение контролю является максимально сильным (). Как и в одноклеточном детерминированном случае, стабильная область окружена областями нестабильности плазмиды, в которых плазмиды элиминируются из популяции хозяина из-за отсутствия стабильного характеристического числа копий. и постоянная недостаточная или избыточная репликация плазмид. Постоянная недостаточная репликация приводит к постепенному разбавлению и возможному исчезновению плазмид из популяции (белая область под стабильной областью на рисунке 4). Постоянная избыточная репликация приводит к увеличению числа копий, что замедляет рост клеток (см. Также уравнение 1), предоставляя плазмидам больше времени для репликации, тем самым еще больше затрудняя рост клеток. Таким образом, свободные от плазмид хозяева, являющиеся результатом стохастических ошибок сегрегации, способны перерастать чрезмерно инфицированные хозяева до тех пор, пока популяция не станет полностью свободной от плазмид (белая область над стабильной областью на рисунке 4). В случае крайнего плазмидного эгоизма (при высоком , низкий ), популяция хозяина коллапсирует под тяжестью чрезмерной репликации плазмиды, прежде чем сегрегантам, свободным от плазмиды, будет предоставлена ​​возможность перерасти чрезмерно инфицированных хозяев и сформировать популяцию без плазмид (черные кластеры на рисунке 4).

Тепловая карта отображает чистую среднюю скорость роста популяции (выраженную как разницу между средним числом делений и смертностью) как функцию параметров репликации плазмиды. а также , усредненное по трем независимым стохастическим многоклеточным моделям с однородностью плазмиды (без мутаций) и фиксированной скоростью ингибитора продукции. Белые области ниже и выше стабильной области представляют области пространства параметров плазмиды, в которых плазмиды элиминируются из популяции из-за последовательной недостаточной или избыточной репликации соответственно. Черные кластеры в верхнем левом углу представляют распад популяции хозяина под тяжестью чрезмерной репликации плазмиды. Горизонтальная пунктирная линия указывает значение для которого система достигает оптимального роста при (см. рисунок 5). Наконец, черный лестничный путь обрисовывает в общих чертах эволюцию ЧПУ в стохастическом моделировании, где а также разрешено мутировать с вероятностью и фиксированная ставка ингибитора продукции.

Уровни послушания и эффективность контроля репликации

Стохастичность репликации и сегрегации плазмиды при делении клеток приводит к распределению числа копий в популяции, которое происходит среди всех инфицированных плазмид хозяев в ходе моделирования. Мы исследовали эффекты послушания ( или охрана , поскольку они взаимозаменяемы из-за однородности популяции плазмид) на особенности этих распределений, учитывая поперечное сечение ландшафта приспособленности для фиксированного значения базовой скорости репликации плазмид , что соответствует оптимальной чистой скорости роста при максимальном ЧПУ (). Слабый режим ЧПУ в этом разрезе фитнес-ландшафта () нестабильна, и плазмиды в конечном итоге удаляются из популяции (см. рисунок 5). Широта распределения количества копий в этом режиме отражает обширные вариации и дрейф количества копий в популяции из-за усиления стохастических колебаний количества копий [15]. Преобразование распределений начинается в промежуточном диапазоне послушания (), с появлением четкого пика, тем не менее, наличие тяжелого хвоста указывает на сохранение нестабильности репликации плазмиды. Эти нестабильности минимизируются в области сильных ЧПУ () по мере того, как распределения становятся все менее искаженными из-за повышения эффективности управления стохастическими колебаниями количества копий и соответствующего уменьшения вариации количества копий. В то же время несоответствие среднего количества копий дистрибутивов и номер копии оптимальная для роста хозяина (см. также уравнение 1), становится ниже с увеличением послушания. , тем самым вызывая ускорение чистого среднего роста хоста до оптимальной скорости при максимальном ЧПУ ().

Эффекты послушания (увеличение количества копий, контроль ) от распределения числа копий плазмид при фиксированном значении базовой скорости репликации плазмид , выбранный таким образом, чтобы приспособленность популяции для этого значения была оптимальной при максимальном ЧПУ (см. горизонтальную пунктирную линию на рисунке 4). Слабый режим ЧПУ () нестабильна, и плазмиды в конечном итоге удаляются из популяции. Распределение количества копий дано для разных значений (вверху слева синий для , зеленый для , красный для , голубой для и пурпурный для ). Распределения были рассчитаны путем регистрации количества копий всех инфицированных плазмид хозяев в течение всего процесса многоклеточного стохастического моделирования. Несоответствие среднего количества копий и номер копии оптимальная для роста хозяина, дается как функция (вверху справа), а также стандартное отклонение (внизу слева) и перекос (внизу справа) распределения количества копий.

Эволюция коллективной сдержанности

Изучив эффекты взаимодействия гомогенных плазмид на рост хозяина и стабильность плазмиды, мы теперь задаемся вопросом, как эти эффекты влияют на эволюцию параметров репликации плазмид в более широком контексте конфликта между уровнями отбора. С этой целью мы вводим вариации плазмиды в наши многоклеточные стохастические модели: каждое событие репликации плазмиды подразумевает возможность мутации с вероятностью , и в этом случае изменяется значение ровно одного из параметров репликации плазмиды, выбранных случайным образом с равной вероятностью.

Начиная с начальной популяции плазмид, которые не реагируют на ингибиторы (т. Е. ), мы допускаем а также развиваться при фиксированной скорости производства ингибитора . Результирующая эволюционная динамика, показанная на рисунке 4, демонстрирует появление эффективного контроля репликации, обусловленного синергизмом между внутриклеточным отбором, благоприятствующим немедленным репродуктивным достижениям плазмид (более высокий эгоизм , более низкое послушание ), и межклеточный отбор, благоприятствующий эволюционным приспособлениям к тем областям пространства параметров плазмиды, где чистая скорость роста хозяина увеличивается. Фактически, и из-за временной и эпигенетической природы стохастических флуктуаций числа копий, межклеточный отбор воздействует на чистую скорость роста хозяина, накопленную за несколько поколений, и, следовательно, на распределение числа копий, связанное с конкретными конфигурациями репликации плазмиды. параметры [27]. Таким образом, эволюционные корректировки, которым способствует межклеточный отбор, проявляются в форме кооперативных мутаций параметров плазмиды, таких как усиление самоограничения плазмиды (снижение эгоизма ) или повышенная чувствительность к ингибитору (более высокое послушание ), которые изменяют режим репликации плазмиды таким образом, чтобы обеспечить уменьшение, во-первых, несоответствия между оптимальными и значит количества копий и, во-вторых, в величине колебаний количества копий (т. е. вариации распределения количества копий). Таким образом, эволюция ЧПУ разворачивается с нарастающей последовательностью эгоистичных и кооперативных мутаций параметров плазмиды, которые развиваются по градиенту ландшафта приспособленности хозяина, приводя систему к области оптимального роста хозяина при максимальном ЧПУ. Дальнейшая эскалация предотвращается из-за ограничений, которые налагаются на значения параметров плазмиды, отсутствие таких ограничений приведет к эффекту храпового механизма, при котором последовательность эгоистичных и кооперативных мутаций будет продолжаться бесконечно, ограничиваясь только затратами на производство соответствующих факторов, участвующих в плазмиде. репликация (инициаторы и ингибиторы).

Тот же результат сотрудничества (развитие эффективной системы ЧПУ) достигается, когда мы разрешаем все три параметра репликации плазмиды. , а также эволюционировать из начального состояния, в котором плазмиды не производят () ни ответить () к ингибиторам (см. рисунок 6). В этом случае кооперативные мутации могут быть либо цис-специфичными (высшее послушание ), как и раньше, или транс-специфичные (более строгая ), в этом случае мутация, которая увеличивает скорость продуцирования ингибитора отдельной плазмидой будет влиять не только на мутант, но и на все плазмиды во внутриклеточном пуле репликации (из-за член в уравнении 2). Цис-специфичность подразумевает, что кооперативная мутация, индуцирующая более высокую чувствительность к ингибитору, является дорогостоящей на внутриклеточном уровне, поскольку снижает шансы мутанта на немедленный репродуктивный успех в пуле репликации. Транс-специфичность вводит принудительный элемент в кооперацию, потому что продукция ингибиторов регулирует репликацию всех плазмид в пуле. Это также создает потенциал для подрывных плазмидных стратегий, в соответствии с которыми отдельные плазмиды могут получить преимущество в пуле репликации, усердно производя ингибитор (высокая степень контроля ) при сохранении низкой чувствительности (послушание ) к самому ингибитору. Тем не менее, эта возможность для оппортунистического поведения не препятствует появлению механизма ЧПУ. Фактически, мы обнаружили, что вариация параметров плазмиды внутри клеток довольно низкая (см. Таблицу 1), так что хозяева населены более или менее гомогенной популяцией плазмид (т. Е. Плазмиды сильно связаны со своими внутриклеточными соседями) из-за к отсутствию миграции плазмиды (горизонтальной передачи) между хозяевами. Степень гомогенности плазмиды между хозяевами снижается примерно на порядок по сравнению с ее значением внутри хозяев, таким образом создавая дифференциал роста хозяина, на который действует межклеточный отбор, способствуя более строгому контролю над репликацией плазмиды.

Средние значения параметров плазмиды (синий), (зеленый) и (красный) с течением времени, показывая эволюцию механизма ЧПУ в стохастическом многоклеточном моделировании с вероятностью мутации . Результаты были усреднены по 50 независимым симуляциям с одинаковыми начальными условиями.

Таблица 1

внутри хостовмежду хозяевами
В таблице приведены внутриклеточные (внутри хозяев) и межклеточные (между хозяевами) вариации параметров репликации плазмид, представленные как стандартное отклонение. , усредненное по времени и через 50 независимых стохастических многоклеточных симуляций (соответствующие средние значения параметров плазмиды показаны на рисунке 6). Внутриклеточная вариация рассчитывается для всех плазмид внутри хозяина относительно среднего внутриклеточного значения хозяина и усредняется по всем хозяевам в популяции. Межклеточная вариация рассчитывается для внутриклеточных средних значений всех хозяев относительно среднего (глобального) популяции.

Влияние затрат на патрулирование на развитие ЧПУ

Мы также исследовали влияние затрат на охрану полиции на развитие коллективного сдерживания и общую производительность населения, введя дополнительный термин затрат. в уравнении 1, где стоимость производства единицы ингибитора, оплачиваемая хостом. Это означает, что теперь существует выбор на межклеточном уровне, направленный против производства контролирующих ресурсов, из-за связанных с этим затрат на полицейское управление, которые замедляют рост хоста. На Рисунке 7 показано, что увеличение затрат на полицейскую деятельность соответствует уменьшению производства полицейских ресурсов (), но не коллапс подчинения плазмиды () к полиции. Напротив, послушание не только сохраняется, но и немного увеличивается с ростом затрат на охрану полиции. В то же время базальная скорость репликации плазмиды () уменьшается, чтобы компенсировать постепенное сокращение доступности полицейских ресурсов (). В результате система ЧПУ остается работоспособной повсюду (поскольку на межклеточном уровне все еще есть выбор для высокого подчинения). ), но становится менее эффективным с увеличением затрат на контроль, а производительность популяции ухудшается из-за более низкой скорости деления для хостов и более высокой скорости сегрегационной потери для плазмид (см. рисунок 7).

Средние значения параметров плазмиды (, , ), скорости деления хозяина и потери сегрегации, а также доли инфицированных плазмидой хозяев в популяции (распространение плазмиды) для различных затрат на контроль. Последняя здесь выражается как стоимость производства. на единицу ингибитора относительно постоянной общей стоимости обслуживания на копию плазмиды (например, стоимость экспрессии гена, репликации и т. д.).

Сравнение индивидуального и коллективного ограничения

Положительные эффекты CNC не ограничиваются хозяевами, но также распространяются на плазмиды. Мы оценили преимущества ЧПУ для хостов и плазмид, сравнив результаты наших многоклеточных стохастических симуляций ЧПУ (ЧПУ эволюционируют) к таковым из базовой модели, где контроль отсутствует и плазмиды реплицируются независимо от присутствия других плазмид в том же хозяине (NO-CNC развивается, ). Производительность хозяина оценивалась по средним показателям деления и смертности, тогда как производительность плазмид оценивалась на основе верности вертикальной передачи и распространения плазмид в популяции хозяев. Рисунок 8 демонстрирует, что все показатели были значительно улучшены, когда ЧПУ работало (моделирование ЧПУ), по сравнению со случаем, когда механизм ЧПУ отсутствовал (моделирование без ЧПУ). Таким образом, положительное влияние механизма ЧПУ на стабильность плазмиды из-за более строгого контроля стохастических флуктуаций числа копий позволяет широко распространить инфекцию хозяина и минимизировать сегрегационные потери в пределах, допускаемых межклеточным отбором, тем самым укрепляя устойчивость. плазмидной линии в популяции.

Производительность хозяев измеряется в терминах деления (вверху слева) и показателей смертности (вверху справа), в то время как производительность плазмид измеряется в терминах сегрегационных потерь (внизу слева) и доли инфицированных плазмидами хозяев в популяции ( внизу справа). Скорость сегрегационной потери рассчитывается путем регистрации на каждом временном шаге экземпляров дочерней клетки, свободной от плазмиды, возникающей из инфицированной плазмидой родительской клетки, среди всех делений инфицированных плазмидой клеток. Сравнение проводится между базовой моделью, в которой отсутствует контроль (NO-CNC в синем цвете развивается, ) и модель, в которой позволено развиваться полицейской деятельности и повиновению (ЧПУ в зеленом цвете эволюционировать). Распределения были рассчитаны с использованием значений последних 100000 шагов 50 независимых стохастических многоклеточных симуляций с одинаковыми начальными условиями и вероятностью мутации. .

Наконец, мы также исследовали устойчивость и стабильность установленного механизма контроля среди плазмид против вторжения эгоистичных индивидуумов, то есть плазмид, которые нечувствительны к ингибиторам репликации и реплицируются независимо от присутствия других плазмид в том же хозяине. В частности, мы смоделировали конкуренцию между NO-CNC ( только с ) и ЧПУ () типы (а) путем равномерного смешивания обоих типов внутри хозяев (неоднородность внутри хозяина) и (б) путем раздельного и равного распределения этих двух типов среди разных хозяев в популяции (неоднородность между хозяевами). В каждом случае, который мы рассматривали, мы наблюдали быстрое вытеснение эгоистичного типа из населения. Полное преобладание типа ЧПУ демонстрирует надежность и стабильность механизма коллективного сдерживания перед лицом вторжения эгоистичных элементов, которые обходят механизм контроля, чтобы получить относительное преимущество во внутриклеточном пуле репликации.


Материалы и методы

Таблица реагентов и инструментов

Реагент / Ресурс Ссылка или источник Идентификатор / Каталожный номер
СМИ
Лурия-Бертани (LB) BD Difco от Fisher Scientific DF0446 07 5
M9CA Amresco M9CA средний бульон в порошке много не. 2055C146
Плазмиды
Доноры и получатели
Генотип штамма
Донор RP4 (Лопаткин и другие, 2016 ) DA32838 Eco galK :: cat-J23101-dTomato
pR донор (Лопаткин и другие, 2016 ) DA26735 Eco lacIZYA :: FRT, galK :: mTagBFP2-amp
донор p41 (Лопаткин и другие, 2016 ) Кишечная палочка изолят номер 41
p168 донор (Лопаткин и другие, 2016 ) Кишечная палочка изолят номер 168
p193 донор (Лопаткин и другие, 2016 ) Кишечная палочка изолят номер 193
p283 донор (Гендель и другие, 2015 ) ESBL 242
Донор R6K (Лопаткин и другие, 2016 ) Кишечная палочка C600
Донор R6Kdrd Щедрый подарок от Д. Мазеля (Бахароглу и другие, 2010 ) Кишечная палочка Dh5a
Донор R1 Щедрый подарок от Ф. Дионисио и Дж. Алвеса Гамы (Гама и другие, 2020 ) Кишечная палочка MG1655 Дара
R1drd донор Щедрый подарок от Ф. Дионисио и Дж. Алвеса Гамы (Гама и другие, 2020 ) Кишечная палочка MG1655 Дара
донор pRK100 Щедрый подарок от Т. Сысоевой. Кишечная палочка HB101
Донор RIP113 Щедрый подарок от Д. Мазеля (Бахароглу и другие, 2010 ) Кишечная палочка Dh5a
Получатель RB933 Щедрый подарок от И. Гордо (Леонидас Кардосо) и другие, 2020 ) E. coli lacIZYA::шрам галК::кошка-YFP ∆gatZ::FRT-aph-FRT rpoB H526Y
MG1655 (Лопаткин и другие, 2016 ) Кишечная палочка MG1655 (К-12 Ф - λ - ilvGрфб-50 рф-1)
DA838F (Лопаткин и другие, 2016 ) DA32838 Eco galK :: cat-J23101-dTomato
DA838 (Лопаткин и другие, 2016 ) DA32838 Eco galK :: cat-J23101-dTomato
P (получатель для p41, p193 и p168) Это исследование, лабораторный инвентарь Кишечная палочка MG1655 (К-12 Ф - λ - ilvGрфб-50 рф-1)
Получатель КПН (Гомес-Симмондс и другие, 2015) Klebsiella pnseumoniae изолятор КП0064, СТ17
Программное обеспечение
MATLAB против R2020a https://www.mathworks.com/products/matlab.html N / A
Инструменты
Считыватель планшетов Tecan Infinite Mplex Tecan N / A

Методы и протоколы

Штаммы, среды и условия роста

Эксперименты были начаты с отдельных клонов, собранных с чашек с агаром, инокулированных в 2 мл среды Лурия-Бертани (LB) и инкубированных в течение ночи при 37 ° C в течение ровно 16 ч при встряхивании со скоростью 250 об / мин. По возможности, среда LB была дополнена специфическими антибиотиками. Например, для измерения стоимости приобретения RP4, D, R и адаптированный T выращивали с 50 мкг / мл канамицина (Kan), 50 мкг / мл спектиномицина (Spec) или с обоими, соответственно (таблица S1A приложения). Для всех других комбинаций донора и реципиента соответствующие антибиотики и концентрации можно найти в Таблице S1B Приложения. Все эксперименты проводились в среде M9 (порошок бульона среды M9CA от Amresco, лот № 2055C146, содержащий 2 мг / мл казаминовой кислоты с добавлением 2 мМ MgSO.4, 0,1 мМ CaCl2 и 0,4% мас. / об. глюкозы.)

Генерация адаптированных трансконъюгантов RP4

Для создания адаптированного T отдельные клоны D и R выращивали в течение ночи в соответствии с предыдущим описанием. Через 16 часов все культуры ресуспендировали 1: 1 в M9CA. Равные объемы (по 400 мкл) D и R смешивали в пробирке Эппендорфа и инкубировали в течение 1 ч в охлаждающем инкубаторе при 25 ° C. После периода конъюгации смеси наносили штрихами на чашки Spec-Kan и выращивали в течение 16 часов при 37 ° C, этого достаточно для обеспечения физиологической адаптации (Erickson и другие, 2017) без генетических мутаций (Harrison и другие, 2016 Лопаткин и другие, 2017) и согласуется с предыдущими протоколами для установления трансконъюгантов для оценки стоимости пригодности (Buckner и другие, 2018 Дмитрий и другие, 2019 ).

Количественная оценка стоимости приобретения RP4

Генерировать de novo T, отдельные клоны D и R выращивали в течение ночи и конъюгировали, как описано выше. Параллельно с этим в течение ночи выращивали адаптированные Т-колонии для построения стандартной кривой. Во время периода конъюгации D и R 800 мкл адаптированного T также помещали в пробирку Эппендорфа и помещали в охлаждающий инкубатор при 25 ° C. После периода спряжения de novo T определяли количественно из смеси D и R с использованием либо колониеобразующих единиц (КОЕ), либо путем разбавления в считывающем устройстве для планшетов. Для КОЕ смесь D и R последовательно разводили с приращениями в 10 раз. 10 мкл всех факторов разведения (10 0 –10 7) наносили на чашки с агаром Spec-Kan, затем инкубировали в течение 16 ч при 37 ° C и подсчитывали. Для планшет-ридера смесь D и R разбавляли средой M9CA, содержащей Spec-Kan, и аликвотировали 200 мкл в лунки 96-луночного планшета в трех технических повторностях. Как установлено пилотными экспериментами, de novo T разбавляли в 1000 раз, чтобы получить примерно 2000 клеток на лунку, что оказалось достаточно низким, чтобы предотвратить фоновый рост или конъюгацию.

КОЕ адаптированного тестостерона также определяли количественно в это время с использованием того же протокола, который описан выше. Стандартная кривая была построена с использованием семи факторов разбавления адаптированного T (рис. 2B). Адаптированные Т-клетки разводили в среде M9CA с помощью Spec-Kan, а затем аликвоты по 200 мкл каждого фактора разведения высевали на тот же 96-луночный планшет, также в трех технических повторностях. Затем все лунки покрывали 50 мкл минерального масла для предотвращения испарения и сразу же помещали в планшет-ридер Tecan. Во всех случаях измерения оптической плотности при 600 нм снимали каждые 15 мин в течение как минимум 24 ч, пока все клетки не достигли стационарной фазы. Все данные RP4 были получены как минимум в трех биологических повторах.

Общие затраты на приобретение с другими плазмидами

Тот же протокол конъюгации, описанный выше, использовали для всех дополнительных плазмид с небольшими модификациями. Во-первых, антибиотики, используемые для отбора трансконъюгантов, в каждом случае зависели от кодируемых плазмид генов устойчивости и совместимого штамма реципиента (таблица S1B приложения). Кроме того, из семи факторов разведения, используемых для стандартных кривых RP4 и pR, мы обнаружили, что подмножество факторов разведения в 10 2 X, 10 4 X и 10 6 X достаточно для точной количественной оценки затрат на приобретение обеих плазмид (как при определении со всеми разведениями). Таким образом, эти три фактора разбавления использовались для построения стандартных кривых для оставшейся части экспериментов. Максимальная плотность клеток (определяется OD600) и скорости роста различались в зависимости от штамма и плазмиды в зависимости от эффективности конъюгации. Во всех случаях коэффициент разведения в планшет-ридере определяли на основе пилотных экспериментов для определения наивысшей начальной плотности в лунках без наблюдаемой фоновой конъюгации. В случаях, когда фоновое сопряжение не могло быть полностью устранено, рост вычитался, так что экспоненциальная фаза оставалась. Чтобы оставаться в пределах экспоненциальной фазы, пороговая плотность клеток была установлена ​​равной 50% максимальной плотности, достигнутой для каждого эксперимента, это значение, по-видимому, наиболее последовательно выбирало область, указанную на фиг. 2A, как описано в результатах. Изменение порога в фазе экспоненциального роста качественно не влияет на наши выводы. Наконец, мы отмечаем, что затраты на приобретение были в высокой степени воспроизводимыми между биологическими повторностями (см. Приложение, рис. S10A), во многих случаях вариабельность была больше среди отдельных лунок в данный день, чем между средними внутрисуточными значениями, вероятно, из-за низкого количества клеток. на лунку один раз разводили в 96-луночные планшеты. В тех случаях, когда биологические повторяющиеся результаты были воспроизводимыми и не приводили к различным статистическим выводам, мы вместо этого сосредоточились на технической вариабельности в репрезентативной копии. Таким образом, используя наиболее изменчивые данные в каждом конкретном случае, мы максимизируем строгость связанных статистических выводов. В каждом случае типы реплик, используемые для генерации статистики, показаны в таблице приложения S3A (рис. 3H). Отметим, что независимо от репликатов, используемых для генерации статистики, удельные затраты на приобретение остаются неизменными. Кроме того, соотношение между приобретением и стоимостью приспособленности не изменилось в зависимости от того, использовались ли вместо этого средние биологические реплики (Приложение Рис. S10B).

Расчет скорости роста

куда у2 & gt у1, куда у2 а также у1 OD600 во время т+2 и т−2 соответственно. Время запаздывания по Пренски было найдено по пересечению с координатой x касательной линии, проходящей через максимальную скорость роста, что соответствует геометрическому времени запаздывания на рис. 2А.

Конкурсные эксперименты

Все соревновательные эксперименты были выполнены в предыдущей публикации, и данные были воспроизведены с разрешения Nature Communications (Лопаткин и другие, 2017), который находится под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Вкратце, популяции, не содержащие плазмиды, и популяции, несущие плазмиды, смешивали в соотношении 1: 1 и выращивали в последующих поколениях в течение 14-21 дней. Каждые 24 ч популяции разбавляли в 10000 раз, и через регулярные промежутки времени контролировали КОЕ на дважды селективном агаре.

Модельные расчеты

Моделирование было проведено для расчета наблюдаемой скорости роста, μНаблюдения, и максимальная удельная скорость роста, μ, для диапазона значений α и β (рис. 4A). μНаблюдения был рассчитан, как описано в Приложении уравнение S6. μНаблюдения был определен как численно отличающийся от μ на основании любой наблюдаемой скорости роста, которая упала ниже 98% от максимального значения (например, если μНаблюдения & lt 0,98 * μ). Во всех случаях для подгонки данных вычислялась с использованием функции fminsearch в MATLAB. fminsearch - это функция оптимизации, которая сводит к минимуму любую заданную пользователем целевую функцию и требует установки начальной оценки параметра (ов). В нашем случае мы реализовали эту подгонку, минимизируя разницу между решением ODE для S D + S A и кривыми необработанных данных, как показано в Приложении на рис. S7, поскольку ρ было ограничено экспериментальной оценкой отношения скоростей роста между адаптированным и de novo популяций, β был единственным оставшимся свободным параметром, который нужно было подогнать. Таким образом, для каждой плазмиды начальная оценка β была установлена ​​как время геометрического запаздывания соответствующей кривой роста, а результат оптимизации fminsearch был оценкой β, которая наилучшим образом соответствовала нашим экспериментальным данным.


Использованная литература

Slater FR, Bailey MJ, Tett AJ, Turner SL: Прогресс в понимании судьбы плазмид в бактериальных сообществах. Женская микробиология, экология. 2008, 66 (1): 3-13. 10.1111 / j.1574-6941.2008.00505.x.

Frost LS, Leplae R, Summers AO, Toussaint A: Мобильные генетические элементы: агенты эволюции с открытым исходным кодом. Обзоры природы Микробиология. 2005, 3 (9): 722-732. 10.1038 / nrmicro1235.

Эберхард WG: Эволюция бактериальных плазмид и уровни отбора. Ежеквартальный обзор биологии. 1990, 65 (1): 3-22. 10.1086 / 416582.

Медини Д., Донати С., Теттелин Х, Масиньяни В., Раппуоли Р.: Пангеном микробов. Текущее мнение в области генетики и развития. 2005, 15 (6): 589-594.

Цуда М., Тан Х.М., Ниси А., Фурукава К.: Мобильные катаболические гены у бактерий. Журнал биологии и биоинженерии. 1999, 87 (4): 401-410. 10.1016 / S1389-1723 (99) 80086-3.

Хоменков В.Г., Шевелев А.Б., Жуков В.Г., Загустина Н.А., Безбородов А.М., Попов В.О.: Организация метаболических путей и молекулярно-генетические механизмы деградации ксенобиотиков у микроорганизмов: обзор. Прикладная биохимия и микробиология. 2008, 44 (2): 117-135.

Dutta C, Pan A: горизонтальный перенос генов и бактериальное разнообразие. Журнал биологических наук. 2002, 27 (1): 27-33. 10.1007 / BF02703681.

Осборн А.М., Болтнер Д.: Когда фаг, плазмиды и транспозоны сталкиваются: геномные острова и конъюгативные и подвижные транспозоны как мозаичный континуум. Плазмида. 2002, 48 (3): 202-212. 10.1016 / S0147-619X (02) 00117-8.

Дэвисон Дж .: Генетический обмен между бактериями в окружающей среде. Плазмида. 1999, 42 (2): 73-91. 10.1006 / Plas.1999.1421.

Bergstrom CT, Lipsitch M, Levin BR: Естественный отбор, инфекционный перенос и условия существования бактериальных плазмид. Генетика. 2000, 155: 1505-1519.

Заневельд Дж. Р., Немергут Д. Р., Найт Р.: Все ли горизонтальные переносы генов созданы равными? Перспективы механизированного исследования паттернов ГПГ. Микробиология-SGM. 2008, 154: 1-15. 10.1099 / mic.0.2007 / 011833-0.

Fernández-López R, Garcillán-Barcia MP, Revilla C, Lázaro M, Vielva L, dlC F: Динамика генетической основы IncW подразумевает общие тенденции в эволюции конъюгативных плазмид. FEMS Microbiology Reviews. 2006, 30 (6): 942-966. 10.1111 / j.1574-6976.2006.00042.x.

Севаллос М.А., Сервантес-Ривера Р., Гутьеррес-Риос Р.М.: Семейство плазмид repABC. Плазмида. 2008, 60 (1): 19-37. 10.1016 / j.plasmid.2008.03.001.

Bentley SD, Parkhill J: Сравнительная геномная структура прокариот. Ежегодный обзор генетики. 2004, 38: 771-792. 10.1146 / annurev.genet.38.072902.094318.

Брилли М., Менгони А., Фонди М., Баззикалупо М., Лио П., Фани Р.: Анализ плазмидных генов путем филогенетического профилирования и визуализации гомологических отношений с использованием Blast2Network. BMC Bioinformatics. 2008 г.

Пелег А.Ю., Зайферт Х., Патерсон Д.Л.: Acinetobacter baumannii: появление успешного возбудителя. Обзоры клинической микробиологии. 2008, 21 (3): 538-582. 10.1128 / CMR.00058-07.

Juni E: Межвидовая трансформация Acinetobacter: Генетические доказательства для вездесущего рода. J Bacteriol. 1972, 112 (2): 917-931.

Chen TL, Siu LK, Lee YT, Chen CP, Huang LY, Wu RCC, Cho WL, Fung CP: Acinetobacter baylyi как возбудитель оппортунистической инфекции. Журнал клинической микробиологии. 2008, 46 (9): 2938-2944. 10.1128 / JCM.00232-08.

Дийксхорн Л., Немек А., Зейферт Х: Возрастающая угроза в больницах: множественная лекарственная устойчивость Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 2007, 5 (12): 939-951. 10.1038 / nrmicro1789.

Дэвис К.А., Моран К.А., Макаллистер К.К., Грей ПДЖ: множественная лекарственная устойчивость Acinetobacter инфекции конечностей у солдат. Emerg Infect Dis. 2005, 11 (8): 1218-1224.

Немек А., Мусилек М., Майкснерова М., Де Баере Т., Рейден ван дер Т.Дж., Ваничутте М., Дейксхорн Л.: Acinetobacter beijerinckii sp. ноя и Acinetobacter gyllenbergii sp. nov., гемолитические организмы, выделенные от человека. Int J Syst Evol Microbiol. 2009, 59 (Pt 1): 118-124. 10.1099 / ijs.0.001230-0.

Дийксхорн Л., Немек А. Разнообразие рода Acinetobacter. Молекулярная микробиология Acinetobacter. Под редакцией: У. Геришер. 2008, Caister Academic Press, 1-34.

Iacono M, Villa L, Fortini D, Bordoni R, Imperi F, Bonnal RJP, Sicheritz-Ponten T, De Bellis G, Visca P, Cassone A и др.: Пиросеквенирование всего генома эпидемического полирезистентного Acinetobacter baumannii штамм, принадлежащий к группе европейских клонов II. Противомикробные средства и химиотерапия. 2008, 52 (7): 2616-2625. 10.1128 / AAC.01643-07.

Reams AB, Neidle EL: Пластичность генома в Acinetobacter: новые деградационные способности, приобретенные за счет спонтанной амплификации больших хромосомных сегментов. Молекулярная микробиология. 2003, 47 (5): 1291-1304. 10.1046 / j.1365-2958.2003.03342.x.

Mugnier P, Poirel L, Pitout M, Nordmann P: устойчивые к карбапенемам и продуцирующие OXA-23 изоляты Acinetobacter baumannii в Объединенных Арабских Эмиратах. Клиническая микробиология и инфекции. 2008, 14 (9): 879-882. 10.1111 / j.1469-0691.2008.02056.x.

Marti S, Sanchez-Cespedes J, Blasco MD, Ruiz M, Espinal P, Alba V, Fernandez-Cuenca F, Pascual A, Vila J: характеристика гидролизующей карбапенем оксациллиназы Oxa-58 в Acinetobacter геновид 3 клинический изолят. Противомикробные препараты и химиотерапия. 2008, 52 (8): 2955-2958. 10.1128 / AAC.00072-08.

Hawkey PM, Munday CJ: Множественная устойчивость грамотрицательных бактерий. Обзоры в медицинской микробиологии. 2004, 15 (2): 51-61.

Бах Х., Гутник Д.Л.: Новые амфипатические составы на основе полисахаридов и белков. Прикладная микробиология и биотехнология. 2006, 71 (1): 34-38. 10.1007 / s00253-005-0149-9.

Моралес-Хименес Дж., Зунига Дж., Вилла-Танака Л., Эрнандес-Родригес С. Бактериальное сообщество и фиксация азота у красного скипидарного жука, Dendroctonus valens LeConte (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae). Microb Ecol. 2009 г.

de Vries J, Wackernagel W: Интеграция чужеродной ДНК во время естественной трансформации Acinetobacter sp путем нелегитимной рекомбинации, облегченной гомологией. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2002, 99 (4): 2094-2099. 10.1073 / pnas.042263399.

Молодой Д.М., Парк Д., Орнстон Л.Н.: Возможности генетического исследования, предоставляемые Acinetobacter baylyi, универсальный вид бактерий, обладающий высокой способностью к естественному преобразованию. Annu Rev Microbiol. 2005, 59: 519-551.10.1146 / annurev.micro.59.051905.105823.

Decorosi F, Mengoni A, Baldi F, Fani R: Идентификация генов алканмоноксигеназы в Acinetobacter venetianus VE-C3 и анализ мутантов, нарушающих деградацию дизельного топлива. Анналы микробиологии. 2006, 56 (3): 207-214. 10.1007 / BF03175007.

Барберио К., Фани Р.: Биоразнообразие Acinetobacter популяция изолирована от активного ила. Исследования в области микробиологии. 1998, 149 (9): 665-673. 10.1016 / S0923-2508 (99) 80014-X.

Mengoni A, Ricci S, Brilli M, Baldi F, Fani R: Секвенирование и анализ плазмид pAV1 и pAV2 из Acinetobacter venetianus VE-C3 участвует в деградации дизельного топлива. Анналы микробиологии. 2007, 57 (4): 521-526. 10.1007 / BF03175349.

Осборн А.М., Брюс К.Д., Страйк П., Ричи Д.А.: Распространение, разнообразие и эволюция оперона бактериальной устойчивости к ртути (mer). FEMS Microbiol Rev.1997, 19 (4): 239-262. 10.1111 / j.1574-6976.1997.tb00300.x.

Холодий Г., Миндлин С., Горленко З., Петрова М., Хобман Дж, Никифоров В. Транслокация транспозиционно-дефицитных (Tn (d) PKLH2-подобных) транспозонов в естественной среде: механистические выводы из изучения соседних последовательностей ДНК. Микробиология-SGM. 2003, 150: 979-992. 10.1099 / mic.0.26844-0.

Тиан В., Сколник Дж .: Насколько хорошо сохраняется функция фермента в зависимости от парной идентичности последовательностей ?. J Mol Biol. 2003, 333 (4): 863-882. 10.1016 / j.jmb.2003.08.057.

Gonzalez FA, Bonapace E, Belzer I, Friedberg I, Heppel LA: Два различных рецептора АТФ можно различить в фибробластах мыши Swiss 3T6 по их десенсибилизации. Biochem Biophys Res Commun. 1989, 164 (2): 706-713. 10.1016 / 0006-291X (89) 91517-9.

Walther-Rasmussen J, Hoiby N: карбапенемазы типа OXA. J Antimicrob Chemother. 2006, 57 (3): 373-383. 10.1093 / jac / dki482.

Суассон С.М., Макдугалл-Шеклтон Б., Шлейф Р., Вольбергер С. Структурная основа регулируемой лигандом олигомеризации AraC. Наука. 1997, 276 (5311): 421-425. 10.1126 / science.276.5311.421.

Heuer H, Szczepanowski R, Schneiker S, Puhler A, Top EM, Schluter A: полные последовательности плазмид pB2 и pB3 свидетельствуют о недавнем предке группы IncP-1beta без каких-либо дополнительных генов. Микробиология. 2004, 150 (Pt 11): 3591-3599. 10.1099 / mic.0.27304-0.

Rawlings DE: Развитие pTF-FC2 и pTC-F14, двух родственных плазмид семейства IncQ. Плазмида. 2005, 53 (2): 137-147. 10.1016 / j.plasmid.2005.01.001.

Jerke K, Nakatsu CH, Beasley F, Konopka A: Сравнительный анализ восьми Артробактер плазмиды. Плазмида. 2008, 59 (2): 73-85. 10.1016 / j.plasmid.2007.12.003.

Манн Б.А., Слауч Дж. М.: Трансдукция плазмид с низким числом копий бактериофагом P22. Генетика. 1997, 146 (2): 447-456.

Vaneechoutte M, Young DM, Ornston LN, De Baere T, Nemec A, Reijden Van Der T, Carr E, Tjernberg I, Dijkshoorn L: естественно трансформируемый Acinetobacter sp штамм ADP1 относится к недавно описанным видам Acinetobacter baylyi. Прикладная и экологическая микробиология. 2006, 72 (1): 932-936. 10.1128 / AEM.72.1.932-936.2006.

Watson SK, Carter PE: Влияние окружающей среды на Acinetobacter sp. трансформация штамма BD413 в почве. Биология и плодородие почв. 2008, 45 (1): 83-92. 10.1007 / s00374-008-0314-2.

Pontiroli A, Rizzi A, Simonet P, Daffonchio D, Vogel TM, Monier JM: Визуальные доказательства горизонтального переноса генов между растениями и бактериями в фитосфере транспластомного табака. Прикладная и экологическая микробиология. 2009, 75 (10): 3314-3322. 10.1128 / AEM.02632-08.

Johnsborg O, Eldholm V, Havarstein LS: Естественная генетическая трансформация: распространенность, механизмы и функции. Исследования в области микробиологии. 2007, 158 (10): 767-778. 10.1016 / j.resmic.2007.09.004.

Barbe V, Vallenet D, Fonknechten N, Kreimeyer A, Oztas S, Labarre L, Cruveiller S, Robert C, Duprat S, Wincker P и др.: Уникальные особенности, выявленные последовательностью генома Acinetobacter sp ADP1, универсальная и способная к естественным трансформациям бактерия. Исследования нуклеиновых кислот. 2004, 32 (19): 5766-5779. 10.1093 / нар / гх910.

Иваки М., Аракава Ю.: Преобразование Acinetobacter sp BD413 с ДНК коммерчески доступного генетически модифицированного картофеля и папайи. Письма по прикладной микробиологии. 2006, 43 (2): 215-221. 10.1111 / j.1472-765X.2006.01924.x.

Vallenet D, Nordmann P, Barbe V, Poirel L, Mangenot S, Bataille E, Dossat C, Gas S, Kreimeyer A, Lenoble P и др .: Сравнительный анализ Ацинетобактеры: три генома для трех образов жизни. PLoS ONE. 2008, 3 (3): e1805-10.1371 / journal.pone.0001805.

Fournier PE, Vallenet D, Barbe V, Audic S, Ogata H, Poirel L, Richet H, Robert C, Mangenot S, Abergel C и др .: Сравнительная геномика множественной лекарственной устойчивости в Acinetobacter baumannii. PLoS Genet. 2006, 2 (1): e7-10.1371 / journal.pgen.0020007.

Smith MG, Gianoulis TA, Pukatzki S, Mekalanos JJ, Ornston LN, Gerstein M, Snyder M: новые взгляды на Acinetobacter baumannii патогенез выявлен с помощью пиросеквенирования высокой плотности и транспозонного мутагенеза. Genes Dev. 2007, 21 (5): 601-614. 10.1101 / гад.1510307.

Barbe V, Vallenet D, Fonknechten N, Kreimeyer A, Oztas S, Labarre L, Cruveiller S, Robert C, Duprat S, Wincker P и др.: Уникальные особенности, выявленные последовательностью генома Acinetobacter sp. ADP1, универсальная и способная к естественным трансформациям бактерия. Nucleic Acids Res. 2004, 32 (19): 5766-5779. 10.1093 / нар / гх910.

Альтшул С.Ф., Мэдден Т.Л., Шаффер А.А., Чжан Дж., Чжан З., Миллер В., Липман Д.Д.: Gapped BLAST и PSI-BLAST: новое поколение программ поиска в базе данных белков. Nucleic Acids Res. 1997, 25 (17): 3389-3402. 10.1093 / nar / 25.17.3389.

Dorsey CW, Tomaras AP, Actis LA: Последовательность и организация pMAC, an Acinetobacter baumannii плазмида, несущая гены, участвующие в устойчивости к органической перекиси. Плазмида. 2006, 56 (2): 112-123. 10.1016 / j.plasmid.2006.01.004.

Zarrilli R, Vitale D, Di Popolo A, Bagattini M, Daoud Z, Khan AU, Afif C, Triassi M: плазмидный ген blaOXA-58 придает устойчивость к имипенему Acinetobacter baumannii изолят из ливанской больницы. Антимикробные агенты Chemother. 2008, 52 (11): 4115-4120. 10.1128 / AAC.00366-08.


Транспортные средства, репликаторы и межклеточное движение генетической информации: эволюционное рассечение бактериальной клетки

Биосфера прокариот очень разнообразна во многих отношениях. Любая конкретная бактериальная клетка может содержать в различных комбинациях вирусы, плазмиды, транспозоны и другие генетические элементы вместе со своими хромосомами. Эти агенты взаимодействуют в сложных средах различными способами, вызывая множество фенотипических эффектов на их клетки-хозяева. В этом обсуждении я провожу вскрытие бактериальной клетки, чтобы упростить разнообразие на компоненты, которые могут помочь приблизиться к океану деталей в эволюционирующих мирах микробов. Сама клетка отделена от всех генетических репликаторов, которые используют клеточный носитель для сохранения и размножения. Я представляю классификацию, которая группирует различные репликаторы в соответствии с их потенциалом горизонтального перемещения между клетками и в соответствии с их влиянием на приспособленность существующих в них клеток-хозяев. Классификация используется для обсуждения и улучшения способов, с помощью которых мы приближаемся к общим эволюционным тенденциям в микробных сообществах. Более того, классификация используется как инструмент, помогающий формулировать эволюционные гипотезы и обсуждать возникающие бактериальные патогены, а также способствовать пониманию средних фенотипов различных репликаторов в целом. Также обсуждается, что любая данная биосфера, содержащая носители прокариотических клеток и генетические репликаторы, может естественным образом эволюционировать, чтобы иметь горизонтально движущиеся репликаторы различных типов.

1. Введение

Известно, что вирусы, поражающие прокариотические клетки, чрезвычайно разнообразны с точки зрения генетической информации [1, 2]. Большинство новых вирусных изолятов, вероятно, имеют по крайней мере некоторые гены, которые не имеют гомологов ни с одним из ранее известных генов, в том числе в геномах родственных вирусов [3]. Тем не менее, существует спор о том, действительно ли новые гены могут возникать в вирусах [3]. Вирусы зависят от клеточных ресурсов, таких как нуклеотиды, аминокислоты и липиды, для производства большего количества вирусов, поэтому кажется оправданным вопрос, используют ли они также клеточные гены для своей генетической информации. Тем не менее, когда вирусные гены сравнивают с другими генами в базах данных, часто оказывается, что у них нет клеточных аналогов [2]. Откуда же тогда берутся эти вирусные гены? Были ли они получены от клеточного хозяина, который мы просто не секвенировали раньше? Или же, возможно, клеточные гены просто быстро развиваются в вирусных геномах, так что их общее происхождение с генами хозяина больше не может быть получено? Или, может быть, действительно ли новые гены возникают в самих вирусах?

Фортер и Прангишвили из Института Пастера утверждали, что суть спора, по-видимому, заключается в представлении о том, что вирусы часто рассматриваются как просто инкапсулированные в белки внеклеточные формы [4], которые только воруют клеточные ресурсы (включая гены) для своих собственных целей. [3, 5, 6]. Возьмите любой учебник по вирусам, и большинство изображений вирусов представляют собой различные типы вирусных оболочек, состоящих из белков (а иногда и липидов), которые окружают вирусный геном. Но эти инфекционные вирусные частицы или вирионы инертны во всех отношениях, если только они не сталкиваются с восприимчивой клеткой-хозяином [7]. И из-за этой инертности вирионов трудно понять, как у вируса могут появиться совершенно новые гены.

Ответ, естественно, заключается в том, что вирусы не могут продуцировать новые гены во время своего внеклеточного состояния, и, следовательно, любое потенциальное событие для появления нового вирусного гена все еще должно происходить в клетке во время цикла репликации вируса [5]. Но если ген появляется в геноме вируса, то будет ли он скорее вирусом, а не клеткой, которая была источником этого гена? Или, иначе говоря, разве не вирус выиграл от появления новой генетической информации? Фактический процесс, который приводит к тому, что генетическая информация приобретает статус гена, все равно будет происходить из-за тех же процессов, что и происхождение генов в хромосомах (это различные типы генетических изменений, такие как точечные мутации, вставки, делеции, дупликации генов, и т. д.), но эти изменения будут выбраны в связи с их улучшением пригодности вируса. Это рассуждение заставило Фортерре предложить модель, в которой вирусы рассматриваются по существу как клеточная форма жизни, которая также может иметь внеклеточное состояние [7, 8]. Вирус не является строго эквивалентом вирусного генома, заключенного в белки. Напротив, внеклеточную форму вируса следует обозначать как вирион, и этот вирион не следует принимать за вирус. Вирусы в полном смысле слова - это организмы, которые живут внутри клеток (то есть организмы, кодирующие рибосомы) и могут преобразовывать другие клетки в вирус-клеточные организмы, производя больше вирионов. Другими словами, вирусы могут использовать внеклеточную инкапсулированную форму для передачи своей генетической информации от одной клетки к другой. Фортер придумал термин вироцелл, который относится к стадии вирусной жизни, в течение которой вирус находится внутри клетки [7]. Организм вироцеллы действительно является одновременно (кодирующим капсид) вирусом и хромосомой (кодирующей рибосомы), и фактический фенотип вироцеллы кодируется обоими этими генетическими объектами. Вироэлементы, как и клетки, способны нести новую генетическую информацию, и, таким образом, подход к вирусам с этой точки зрения должен устранить любые споры о появлении новой генетической информации в вирусах.

Линия рассуждений Фортерра наряду с моими собственными исследованиями различных генетических элементов (включая характеристику умеренных и вирулентных вирусов [9, 10] определение общего предка между плазмидами, вирусами и хромосомными элементами [11] проведение эволюционных экспериментов с бактериями, вирусами, и плазмиды [12, 13], а также более теоретические работы по горизонтальному перемещению генетической информации [14, 15]) послужили вдохновением для этой статьи. В самом деле, можно было бы спорить в более общих терминах, что означает, что прокариотические клетки могут быть (и часто являются) химерами различных типов генетически воспроизводимых элементов. Концепция Virocell эффективно устраняет многие путаницы между вирусами и вирионами и их взаимоотношениями с клетками. Тем не менее, вироцелл - это лишь частный случай среди всех возможных типов прокариотических организмов. Бактериальные и архейные клетки могут также содержать конъюгативные плазмиды, различные типы транспозонов, дефектные профаги и многие другие независимые репликаторы, отличные от рибосомы, кодирующей прокариотическую хромосому. Вместе эти репликаторы могут производить организмы во всех возможных комбинациях. Чтобы аргументы о вироцеллах согласовывались с другими потенциальными химерами генетических репликаторов, сама клетка должна рассматриваться как отдельный объект от всех генетических репликаторов (включая хромосомы), которые используют клеточную структуру для репликации. В следующих главах я проведу эволюционное вскрытие бактериальной клетки. Это приведет к разделению клеточных носителей и репликаторов друг от друга и, таким образом, предоставит один из возможных способов приблизиться к эволюции бактериальных организмов.

2. Транспортные средства и репликаторы

Транспортное средство - это любая единица, достаточно дискретная, чтобы казаться заслуживающей названия, в которой находится набор репликаторов и которая работает как единица для сохранения и размножения этих репликаторов.», - писал Ричард Докинз в Расширенный фенотип. Докинз использовал концепции репликаторов и носителей в аргументе, который утверждал, что эволюция в конечном итоге работает на уровне генетической информации, а не на уровне популяций организмов, видов или даже клеток. Репликаторы относятся к пакетам генетической информации, которые отвечают за любой эффективный фенотип носителя. Сам носитель может быть клеткой, многоклеточным организмом или, например, организмом-хозяином паразита. «Автомобиль - это не репликатор», - утверждал Докинз, пытаясь подчеркнуть, что эволюционирует репликатор (например, хромосома паразита), а не носитель (например, паразитированная клетка). Однако это различие иногда может показаться тривиальным, поэтому оно вызвало некоторый диссонанс среди биологов-эволюционистов.

Тем не менее, работа Докинза была сосредоточена в основном на объяснении эволюционных проблем эукариотических организмов, но эволюция, центрированная на репликаторах, естественным образом действует также внутри и между прокариотическими клетками. Действительно, существует огромное разнообразие различных форм генетических репликаторов, которые используют переносчики прокариотических клеток для своего сохранения и размножения. Любой конкретный прокариот, который живет в этой биосфере, будь то бактерия на вашем лбу или археон на дне Тихого океана, содержит хромосому, но может также содержать коллекцию других репликаторов, включая плазмиды, транспозоны и вирусы. Некоторые из репликаторов, такие как конъюгативные плазмиды и вирусы, способны активно перемещаться между доступными носителями в своей среде, что делает эти репликаторы менее зависимыми от выживания какой-либо конкретной линии клеточных носителей. Следовательно, они не являются неотъемлемой частью какой-либо конкретной бактерии и, таким образом, могут рассматриваться как отдельные формы генетически реплицирующихся сущностей, которые используют клетки для своего размножения и выживания (аналогично вирусам в концепции вироцелл Forterre).

Непрерывная борьба за существование внутри прокариотических носителей и между ними изменяет фенотипы репликаторов. Было проделано много теоретической и экспериментальной работы, чтобы прояснить функции и эволюционные траектории вирусов, бактериальных клеток и плазмид в различных экологических контекстах и ​​под различным давлением отбора. Однако в этом обсуждении я отхожу от любого конкретного типа репликатора или организма и исследую с общей точки зрения, может ли потенциал бокового движения (или его отсутствие) репликаторов помочь пролить свет на некоторые эволюционные аспекты прокариотической биосферы. . Это обсуждение пытается дать интуитивный взгляд на эгоистичные гены и различные типы репликаторов в бактериальных и архейных клетках. Я намерен сделать текст простым и удобочитаемым, независимо от того, знаком ли читатель с бактериями, вирусами, плазмидами или, если уж на то пошло, с теорией эволюции. Более того, учитывая огромное количество деталей в микробном мире, я надеюсь, что читатели поймут, что определенные углы нужно было срезать в разных местах, чтобы текст оставался в пределах реалистичной длины.

Кроме того, в попытке сохранить простоту, в этой статье используются следующая номенклатура и определения. А сотовый автомобиль обозначает прокариотическую клетку с мембранами, ресурсами и всем остальным, но исключает какой-либо генетический материал. Линия клеточного транспортного средства указывает на один носитель и его прямой потомок, которые появляются в результате деления клеток. А репликатор любой достаточно дискретный набор генетического материала (который, кажется, стоит назвать), который использует клеточный носитель для его сохранения и размножения. Репликаторы реплицируются как отдельные единицы, образующие согласованную коллекцию генетического материала, которую можно с разумными усилиями отделить от других репликаторов. Репликаторы могут реплицироваться как часть репликации других репликаторов, поскольку интегративные вирусы реплицируются вместе с размножением хромосомы хозяина, но по существу эти два репликатора могут быть обозначены как две отдельные сущности, учитывая, что интегрирующий вирус может реплицировать свою генетическую информацию также отдельно. от репликации хромосомы. Средство, с помощью которого реплицируется генетическая информация репликатора, не имеет значения. Однако я предпочитаю не давать слишком строгих определений для репликатора, поскольку это может привести к непродуктивным спорам о разделении волос.Тем не менее, следует отметить, что репликаторы не включают рибосомы или другие нуклеиновые кислоты, содержащие молекулы, которые по существу выполняют ферментативную функцию, но не используются в качестве матрицы для их собственной репликации.. Вертикальные отношения или вертикальное наследование репликатора указывает на то, что этот генетический репликатор сохраняет себя внутри делящегося клона клеточных носителей. Потенциал горизонтального движения означает, что репликатор способен внедриться в линию передачи клеток-носителей, где репликатор ранее отсутствовал. Любая функция, которая кодируется или индуцируется репликатором, обозначается как фенотип. Рисунок 1 связывает эти термины с их биологическими аналогами.


ПРИЛОЖЕНИЕ D

Мы рассчитываем Тп, ожидаемое время персистентности плазмиды в популяции с избирательным сканированием. Мы делаем это, по очереди вычисляя элементы уравнения 11 в тексте, которое определяет Тп. Большая часть усилий (вплоть до уравнения D13) приходится на вычисление пр затем мы даем выражения для Та а также Тж.

Сначала вычисляем пр, вероятность того, что после появления хромосомного варианта плазмида будет спасена с помощью выборочного сканирования, прежде чем она исчезнет. Изначально предположим, что хромосомный вариант возникает во время т = 0.

Затем обратите внимание, что пр задается формулой P R = ∫ 0 ∞ P M (t) P X (t) d t, (D1) где пM(т) - вероятность того, что первый мутант появится в течение интервала [т, т + dt) после появления хромосомы, и пИкс(т) представляет собой вероятность того, что плазмида передается в мутантный клон во время ее выборочного сканирования, при условии, что сканирование началось в интервале [т, т + dt).

Не имея веских оснований для более сложного предположения, мы предполагаем, что новые мутации поступают в популяцию как пуассоновский процесс с постоянной скоростью σ. Тогда P M (t) = σ e - σ t. (D2)

Вычислять пИкс(т) используем следующую модель. Рассмотрим адаптированное к местным условиям население с фиксированной плотностью N в томе V, так что есть NV присутствуют бактерии. Популяция изначально состоит из бактерий, несущих фокальный ген на плазмиде, которые имеют плотность п(т) вовремя т, и бактерии, несущие фокальный ген на своей хромосоме, которые имеют плотность C(т). Мы предполагаем, что все эффекты приспособленности являются мультипликативными, что преимущество приспособленности фокального гена равно β, а стоимость приспособленности плазмиды равна α. Тогда хромосомная и плазмидоносная популяции имеют темпы роста ψ (1 + β) и ψ (1 + β) (1 - α) соответственно. После появления мутанта мы отслеживаем плотность мутантов в популяции как M(т), и мы предполагаем, что мутация, которую он несет, имеет преимущество в пригодности б, давая ему скорость роста ψ (1 + б), поскольку он не несет ни фокального гена, ни плазмиды. Для математической простоты мы пренебрегаем сегрегацией, которая не меняет качественных результатов. Значения этих параметров ограничены следующими предположениями:

Пригодность фокального гена больше, чем стоимость пригодности плазмиды: β & gt α / (1 - α).

Польза для приспособленности от новой мутации больше, чем от фокального гена (так что фокальный ген пойдет на фиксацию): б & gt β.

Следствие критерия Стюарта и Левина: плазмида не может выдерживать конкуренцию с хромосомной версией, компенсируя бремя приспособленности путем переноса: γN & lt ψα (1 + β).

Для моделирования изменений плотности (отслеживаемых заглавными буквами) носителей плазмид, хромосом и мутантов (без учета трансконъюгантов), налагая ограничение на постоянный размер популяции, мы имеем d P (t) dt = [Ψ (1 - α) (1 + β) - Ψ ¯] P + γ PC (D3) d C (t) dt = [Ψ (1 + β) - Ψ ¯] C - γ PC (D4) d M (t) dt = [Ψ (1 + b) - Ψ ¯] M, (D5) где Ψ ¯ (t) = Ψ [(1 - α) (1 + β) P (t) + (1 + β) C (t) + (1 + b) M (t)] ∕ N - средневзвешенный темп роста населения в момент времени. т и вычитается из индивидуальных темпов роста, чтобы поддерживать постоянную численность популяции.

Мы предполагаем, что хромосома появляется в т = 0 у отдельной бактерии это соответствует начальной плотности C(0) = 1/В. После появления хромосомы, но до того, как мутант войдет в популяцию, мы рассматриваем только частоты хромосомных и плазмидоносных типов. В этот период мы отслеживаем частоту плазмид-несущего типа, п = п/(п + C), который можно вычислить из (D3) и (D4) как d p (t) d t = [γ N - Ψ α (1 + β)] p (1 - p). (D6)

Это имеет решение p (t) = (N V - 1) e [γ N - Ψ α (1 + β)] t 1 + (N V - 1) e [γ N - Ψ α (1 + β)] t. (D7)

Предположим, что мутант появляется в определенное время. т = т*. В момент появления мутанта плотности носителей плазмид, хромосом и мутантов, соответственно, в популяции равны P (t ∗) = (N - 1 ∕ V) p (t ∗) (D8 ) C (t ∗) = (N - 1 ∕ V) (1 - p (t ∗)) (D9) M (t ∗) = 1 ∕ V, (D10) где п(т*) определяется выражением (D7). После появления мутанта динамика этих трех популяций задается уравнениями D3, D4 и D5, эта динамика состоит из увеличения числа мутантов (селективный поиск), в то время как число носителей плазмид и хромосом уменьшается.

Мы хотим рассчитать пИксвероятность того, что плазмида хотя бы один раз передается мутантной популяции, создавая трансконъюгант, до того, как носители плазмиды вымрут. Мы используем ожидаемое количество трансконъюгантов, созданных во время сканирования, для расчета вероятности получения по крайней мере одного трансконъюганта во время сканирования. Мгновенная скорость появления трансконъюгантов во время этой развертки составляет γп(т)M(т), так Икс(т*), ожидаемое количество трансконъюгантов в выборочной проверке, начинающейся в момент времени. т = т*, задается формулой X (t ∗) = γ ∫ t ∗ ∞ P (s) M (s) d s, (D11) где п(s) а также M(s) вычисляются путем интегрирования уравнений D3, D4 и D5, начиная с т*, с начальными условиями, заданными уравнениями D8, D9 и D10. Вероятность пИкс(т*) что, по крайней мере, один трансконъюгант появится тогда при выборочном сканировании, начинающемся в момент времени т*, задается формулой P X (t ∗) = 1 - e - X (t ∗). (D12)

Подставляя из (D2) и (D12) в (D1), получаем PR = ∫ 0 ∞ σ e - σ t [1 - e - X (t)] dt = ∫ 0 ∞ σ e - σ t [1 - e - γ ∫ t ∞ P (s) M (s) ds] dt. (D13)

Наконец, чтобы вычислить Тп из уравнения 11 нам нужны выражения для Та а также Тж. Предполагая, что в популяции, фиксированной для плазмидной версии гена, хромосомы проявляются как пуассоновский процесс со скоростью χ, Та = 1 / χ. Тж можно аппроксимировать, предположив, что хромосома исправляет, потому что в этом случае не происходит выборочного сканирования, Тж просто время, необходимое для того, чтобы число хромосом перешло от 1 до & gt N - 1 или эквивалентно, чтобы частота носителей плазмид изменялась от 1 до 1 /N в & lt1 /Н. Это можно вычислить из (D7), установив п(Тж) = 1/N в (D7) и решая для Тж. Это дает T f = 2 ln (N V - 1) Ψ α (1 + β) - γ N. (D14)

Примечание к вычислениям: (D3, D4 и D5) не могут быть решены аналитически (H ofbauer and Sigmund 1988). Однако их просто решить численным интегрированием. Частота клеток, несущих плазмиду, всегда будет снижаться, по крайней мере, так же быстро, как в (D7), поскольку мутанты, если они появятся, только ускорят снижение плазмиды (без учета трансконъюгантов).

Таким образом, интегрирование целесообразно завершить на Тж, время, при котором количество несущих плазмиду клеток составляет & lt1. Таким образом, для вычислительных целей, Тж можно безопасно использовать в качестве верхнего предела обоих интегралов (заменяя ∞) в (D13).