Информация

Что позволяет азацитидину включаться как в ДНК, так и в РНК?

Что позволяет азацитидину включаться как в ДНК, так и в РНК?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Я сделал мини-проект по препарату азацитидин для своего класса фармакологии и узнал, что азацитидин обладает способностью встраиваться как в ДНК, так и в РНК. Я думаю, что это действительно уникально, потому что похожий препарат, децитабин, включен исключительно в ДНК. Существуют ли какие-либо конкретные физические / структурные характеристики азацитидина, которые позволяют ему влиять на структуру и функцию ДНК / РНК? Любая помощь будет принята с благодарностью!


Если вы посмотрите в самое начало страницы Википедии, вы увидите, что азацитидин является аналогом цитидина,Cписьмо славы как ДНК, так и РНК. Децитабин является дезоксипроизводным и, следовательно, может быть включен только в дезоксирибонуклеиновую кислоту или ДНК.

Далее следует отметить, что по структуре азацитидин является производным рибонуклеозида и предпочтительно включен в РНК. Однако он может метаболизироваться до 5-аза-2'-дезоксицитидин-трифосфата и, таким образом, включаться в ДНК.


Химическая биология на перекрестке молекулярной структуры и механизма

Химическое понимание биологической функции - это святой Грааль структурной биологии. Малые молекулы играют центральную роль в качестве строительных блоков, эффекторов и зондов макромолекулярной структуры и функции.

Недавний всплеск интереса к химической биологии отражает увлечение исследованиями на стыке химии и биологии, где химические идеи используются для решения интересных биологических и биомедицинских проблем. На самом деле, однако, малые молекулы долгое время играли важную роль в расшифровке ответов на фундаментальные биологические вопросы. Например, использование низкомолекулярных модификаторов ДНК, а затем и дидезоксинуклеозидтрифосфатов, дало первое понимание последовательности ДНК и привело к разработке флуоресцентных аналогов нуклеотидов, которые позволили провести секвенирование всего генома. Ранние низкомолекулярные индикаторы внутриклеточного кальция привели к открытию изменений концентрации кальция, которые сигнализируют обо всем, от оплодотворения яйцеклетки до формирования памяти.


Стенограммы

Возможно, самым замечательным открытием в современной биологии РНК является осознание разнообразия транскриптома. Технологии, основанные на секвенировании следующего поколения (NGS), продемонстрировали существование многих новых классов транскриптов и большого разнообразия транскриптов, кодирующих белок, как изоформ, так и с точки зрения синонимичных вариантов. Разнообразие транскриптома и его взаимодействие с фенотипами было основной темой обоих основных докладов. Бен Бленкоу (Университет Торонто) представил концепцию альтернативных регуляторных сетей сращивания и их роль в развитии и расстройствах аутистического спектра. Бленкоу проиллюстрировал, как анализ данных NGS позволил открыть новый класс микроэкзонов (3–27 нуклеотидов), которые сильно консервативны и альтернативное исключение которых связано с фенотипом аутизма. Методы количественной оценки изоформ обсуждались Эдуардо Эйрасом (Университет Помпеу Фабра, Барселона, Испания), который объяснил, как метод SUPPA обеспечивает высокую вычислительную производительность за счет разделения отображения чтения и аннотации транскрипта. Методологии количественной оценки изоформ на основе данных RNA-seq временных рядов с использованием метода DICEseq были также представлены на стендовой сессии Юаньхуа Хуанг (Эдинбургский университет, Великобритания). Естественно, присутствие молекул изоформ РНК не сразу подразумевает экспрессию изоформы на уровне белка, поскольку регуляция трансляции может предпочтительно выбирать только подмножество изоформ. Этот вопрос был задан Лоренцо Кальвиелло (Центр молекулярной медицины Макса Дельбрюка, Берлин, Германия), который использовал данные профилирования рибосом и инструмент трансляционной аннотации с учетом сплайсинга (SaTAnn). Этот анализ показал, что почти 55% генов (в клетках человека HEK293) транслируют одну изоформу, и подчеркнул широко распространенный контроль трансляции. SaTAnn также получил награду за лучшее сокращение, преодолев жесткую конкуренцию со стороны CRAC и BUM-HMM (см. Ниже).

В то время как альтернативный сплайсинг уже давно признан основным фактором, определяющим разнообразие транскриптомов, недавние исследования также проливают свет на функциональное значение синонимичных вариантов, то есть транскриптов, которые различаются только некодирующей областью. Кристин Майр (Мемориальный онкологический центр им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк) описала, как варианты транскриптов с разными 3'-UTR могут вызывать совершенно разные функции в белке, который они кодируют. Ярким примером является транскрипт CD47 у человека: варианты с длинной 3'-UTR предпочтительно связываются белком HuR (из-за большого количества сайтов связывания HuR на длинной UTR), что затем приводит к локализации на мембране зарождающейся белка, тогда как белки CD47, синтезированные из короткого варианта 3'-UTR, остаются в перинуклеарной локализации. Варианты более коротких транскриптов также могут возникать в результате альтернативного использования сайтов полиА, тема презентации Кристины Лесли (также из Мемориального онкологического центра им. Слоана Кеттеринга, Нью-Йорк), хотя в этом случае более короткий транскрипт в основном приводит к усеченному белку или к не- кодирующая РНК (нкРНК).

Открытие большого разнообразия новых нкРНК было также одним из главных достижений в технологиях NGS. НкРНК остаются, однако, в значительной степени загадочными в своей биологической функции. Альбин Санделин (Центр биотехнологических исследований и инноваций, Копенгаген, Дания) описал данные экспериментов по кэп-анализу экспрессии генов (CAGE), иллюстрирующие распространенность двунаправленной транскрипции, часто приводящей к парам мРНК-нкРНК. Он также объяснил, как особенности генома, такие как плотность сайтов полиА или близкорасположенные сайты начала транскрипции, влияют на экспрессию нкРНК. Игорь Улицкий (Институт Вейцмана, Реховот, Израиль) использовал синтению для выяснения функции и происхождения lincRNA (длинные межгенные ncRNAs), подчеркнув умеренный уровень консервативности последовательностей, частично объясняемый присутствием энхансеров в lincRNAs. Методологии сравнения последовательностей, первоначально разработанные для изучения генов паралогов, также обсуждались Яной Хертель (Университет Лейпцига, Германия) для изучения эволюции нкРНК. Наконец, Тодд Лоу (Калифорнийский университет, Санта-Круз, США) использовал данные о хроматине из проекта «Энциклопедия элементов ДНК» (ENCODE), чтобы обнаружить широко распространенную эпигенетическую регуляцию транскриптома тРНК человека.


1. ВВЕДЕНИЕ

Агрегация белков неумолимо увеличивается с возрастом у всех видов животных и во всех исследованных тканях (Ayyadevara, Balasubramaniam, Johnson, et al., 2016 Ayyadevara, Balasubramaniam, Suri, et al., 2016 Brignull et al., 2007 Cohen et al., 2009 David et al., 2010 Dillin & Cohen, 2011 Reis-Rodrigues et al., 2012). Считается, что специфические агрегированные компоненты, диагностирующие каждое нейродегенеративное заболевание человека, играют причинную роль, поскольку их патологические мутации и / или сверхэкспрессия достаточны для передачи наследственной нейропатии в родословных человека и в моделях трансгенных животных (Bandyopadhyay et al., 2007 Dillin) & Cohen, 2011 Li et al., 2013 Miller et al., 2010 Roodveldt et al., 2009). Белки, требующие структурной гибкости, часто включают неупорядоченные области, что делает их уязвимыми для агрегации, другие белки подвержены агрегации только после окисления или определенных посттрансляционных модификаций (Ayyadevara et al., 2015, 2017 Ayyadevara, Balasubramaniam, Parcon, et al., 2016).

Недавно мы разработали улучшенные реактивы для сшивания с химическим соединением и аналитическое программное обеспечение для идентификации соседних белков в агрегатах на основе пептид-пептидного сшивания и применили его для определения сети связывания белков, или «контактома» агрегатов. Мы начали с общих, нерастворимых в саркозиле агрегатов, выделенных из SY5Y-APP.Sw клетки нейробластомы человека (Ayyadevara et al., 2017), модель семейной болезни Альцгеймера (fAD). Эта работа выявила сложную, неслучайную структуру агрегатов, в которой мегахабы (концентраторы с очень высокой связностью и ≥100 партнеров) и коннекторы концентраторов (белки с низкой связностью, связывающие большие концентраторы) вносят функциональный вклад в сборку больших агрегатов (Balasubramaniam et al. др., 2019). Мы отметили заметное обогащение мегахабов крупными структурными белками, такими как тайтин, анкирины 1–3, несприны 1–3, MAP1A и другие белки нейрофиламентов, исключительно из-за их размера. Мы также наблюдали значительное обогащение различных белков, связывающих нуклеиновые кислоты (Balasubramaniam et al., 2019).


2 Термодинамика и кинетика прионов РНК

Вторичная структура РНК является хорошим приближением к реальной структуре РНК, потому что, в отличие от белков, вторичная структура РНК захватывает большую часть свободной энергии сворачивания. Более того, существует хорошо зарекомендовавшая себя энергетическая модель для вторичных структур РНК, которая широко параметризуется с помощью экспериментов по плавлению [39]. С вычислительной стороны были разработаны алгоритмы термодинамической и кинетической характеристики вторичных структур РНК [28]. В частности, можно эффективно рассчитать энергетически оптимальную структуру, а также свойства структурного ансамбля в термодинамическом равновесии. Топология дискретного ландшафта складчатости [12], которая оказывает сильное влияние на кинетику складчатости, может быть проанализирована подробно. Некоторые подходы моделируют кинетику сворачивания вторичной структуры РНК как случайный процесс с разным разрешением ландшафта сворачивания [9, 45, 26] (см. Обзор [10]). Недавно эти подходы были расширены для работы со складчатыми ландшафтами, которые меняются со временем, как в случае складывания во время транскрипции [19].

2.1 Термодинамика

Пусть набор Ω вторичных структур РНК ограничен теми, которые образованы из вложенных изостерических пар оснований (GC, AU, GU), которые имеют минимальный размер петли шпильки 3 нт и максимальный размер внутренней петли 30 нт. Эти ограничения достаточно широки, чтобы включать подавляющее большинство известных конформаций РНК без псевдоузлов, и они определяют набор структур, для которых экспериментально определенная энергетическая модель E существует [29]. Что наиболее важно с вычислительной точки зрения, эти определения позволяют нам вычислить структуру минимальной свободной энергии (MFE) и равновесную статистическую сумму (Z) в О(п 3) время, где п - длина последовательности.

2.2 Кинетическое складывание

Было показано, что поиск наилучшего пути складывания является NP-трудной задачей [30]. Однако существуют быстрые эвристики для вычисления прямых (кратчайших) путей между двумя структурами, такие как метод findpath [11], доступный в пакете ViennaRNA, а также косвенные пути с использованием, например, RNAtabupath [7]. Для последовательностей короче примерно 100 нуклеотидов пути с минимальным энергетическим барьером могут быть точно рассчитаны с помощью RNAsubopt [46] и барьеров [12]. Первая программа вычисляет список всех вторичных структур РНК в пределах барьеров определенного диапазона энергий, обрабатывает отсортированный список этих конформаций для вычисления всех локальных минимумов и седловых точек, соединяющих их, с помощью алгоритма лавинной рассылки.

2.3 Пейзажи прионов РНК

Прионы РНК - это бистабильные молекулы, которые поддерживают одну структуру (S1), если присутствует как мономер, а другая структура (S2) при димеризации. Чтобы избежать спонтанного сворачивания между S2 а также S1, энергетический барьер βS2S1 должен быть очень высоким (см. рисунок 1).

Схема требований к приону РНК. Красная и синяя части молекулы дополняют друг друга и могут образовывать реакцию межмолекулярной гибридизации. Верхняя панель: S1 а также S2 являются стабильными конформациями, которые не складываются друг в друга, поскольку конформации разделены высоким энергетическим барьером в энергетическом ландшафте. Нижняя панель: S2 дестабилизирует S1 с взаимодействием петли поцелуя типа HIV-Dis. Энергетический барьер для S1S2 сложно перевернуть в S2S2 сложный низкий и, следовательно, допускает спонтанное сворачивание.

Схема требований к приону РНК. Красная и синяя части молекулы дополняют друг друга и могут образовывать реакцию межмолекулярной гибридизации. Верхняя панель: S1 а также S2 являются стабильными конформациями, которые не складываются друг в друга, поскольку конформации разделены высоким энергетическим барьером в энергетическом ландшафте. Нижняя панель: S2 дестабилизирует S1 с взаимодействием петли поцелуя типа HIV-Dis. Энергетический барьер для S1S2 сложно перевернуть в S2S2 сложный низкий и, следовательно, допускает спонтанное сворачивание.

В нашем дизайне S2 образует две 10-нуклеиновые шпильки, которые склонны к гибридизации посредством взаимодействия поцелуев, как сообщается для петли ВИЧ-DIS [8], высококонсервативной последовательности стебель-петля, обнаруживаемой во многих ретровирусах. Важно отметить, что S2 должен не только стабилизировать другие молекулы в S2 конформации при высоких концентрациях, но активно снижают энергетический барьер для повторной укладки S1 в S2 (см. рисунок 1).

Если эти свойства ландшафта выполнены, это гарантирует, что начальная популяция только S1 молекулы не перевернутся в S2 если рефолдинг не запускается внешним механизмом. Однако как только небольшая популяция молекул в S2 конформация присутствует, они могут катализировать рефолдинг S1 молекулы в S2.


Применение и преимущества мечения РНК изотопным фосфатом в масс-спектрометрии

Масс-спектрометрия (МС) стала технологией, позволяющей характеризовать посттранскрипционно модифицированные нуклеозиды в рибонуклеиновых кислотах (РНК). Эти модифицированные РНК, как правило, сложнее полностью охарактеризовать с использованием традиционных технологий секвенирования на основе генома. Как и в случае со многими биологическими молекулами, информация, относящаяся к наличию или отсутствию конкретного соединения (то есть качественное измерение), является только одним шагом в характеристике образца. Дополнительную полезную информацию можно получить, выполнив количественные измерения уровней интересующего соединения в образце. Мечение модифицированных РНК фосфатом было разработано нашей лабораторией для улучшения традиционных методов масс-спектрометрии. Воспользовавшись механизмом действия многих рибонуклеаз (РНКаз), при переваривании образцов РНК в присутствии воды, меченной 18 О, в каждом продукте переваривания образуется 3'-фосфат, меченный 18 О. Мы описываем историческое развитие этого подхода, сравниваем эту стратегию мечения стабильных изотопов с другими, используемыми в масс-спектрометрии РНК, и приводим примеры новых аналитических методов масс-спектрометрии, которые становятся возможными благодаря фосфатной метке таким образом.

Это предварительный просмотр содержимого подписки, доступ через ваше учреждение.


ПЛАН УРОКА

ПРЕДПОСЫЛКИ УРОКА

Чтобы включить исследования преподавателя и дать студентам управляемую, но аутентичную возможность исследования, преподаватели и студенты работают вместе, чтобы определить интересующий ген для редактирования. Первое развертывание этого урока создало мутанты усечения для C. elegans ген klp-4, но можно использовать любую модель или генную мишень по усмотрению инструктора. Хотя мы включили наши конкретные реагенты, мы постарались сделать этот урок общим, чтобы его можно было использовать в различных контекстах / модификациях. Полный список общих материалов и необходимых решений можно найти в вспомогательных файлах 6 и 7 (вспомогательный файл S6: необходимое оборудование для урока / реагенты и вспомогательный файл S7: общие решения).

Каждое занятие в этой лаборатории должно начинаться с обычной беседы с ключевыми моментами и процессами, связанными с развитием навыков. Мы предпочитаем беседы с мелом, а не подготовленные лекции, учитывая различные базовые знания студентов и способность настраиваться в «реальном времени» на основе вопросов и взаимодействий студентов. Беседа с мелом позволяет сосредоточить внимание на роли каждого навыка в научном процессе и на том, как каждый из этих навыков может быть использован для достижения исследовательских целей (вспомогательный файл S8: темы для обсуждения мелом и ответы на вопросы для обсуждения). Кроме того, в конце каждого лабораторного раздаточного материала содержится обсуждение и вопросы по применению, чтобы закрепить ключевые идеи (вспомогательный файл S8). Пример расписания урока можно найти в таблице 1.

МОДУЛЬ 1: ПРИНЦИПЫ ПЦР - СИНТЕЗ ШАБЛОНА ГОМОЛОГИЧЕСКОГО РЕМОНТА (HDR)

Студенты проводят предварительное исследование интересующего гена и консультируются с преподавателем, чтобы выбрать потенциальное редактирование, которое можно было бы внести в этот ген, и разработать кассеты с заданным ремонтом, направленным на гомологию (HDR) (Вспомогательный файл S9: Рекомендации по консультированию по студенческим проектам) . В ходе этого процесса студенты изучат основы программного обеспечения для молекулярного клонирования, базовые навыки биоинформатики и познакомятся с основной литературой, которая им понадобится для оценки своих плакатов.

Учащиеся используют программное обеспечение для молекулярного клонирования для создания праймеров для амплификации последовательности для их детонации HDR в кассете, обращая внимание на добавление плеч гомологии и поддержание рамки считывания после успешной вставки (вспомогательный файл S10: Лаборатория 1 - ПЦР и дизайн праймеров и 7 ). Особое внимание уделяется 5'-3'-ориентации ДНК, предположению о противоположной последовательности цепей и термодинамическим свойствам плавления и отжига комплементарных ДНК.

После проведения реакций ПЦР небольшие аликвоты каждой реакции запускаются на агарозных гелях для анализа (вспомогательный файл S11: Лаборатория 2 - Настройка реакций ПЦР, вспомогательный файл S12: Лаборатория 3 - Электрофорез в агарозном геле ДНК и рисунок 1A). Студенты должны уметь предугадывать размер продукта, а затем анализировать свои данные и определять потенциальные положительные реакции. Затем потенциально положительные образцы очищают и секвенируют (вспомогательный файл S13: Лаборатория 4 - ПЦР-очистка и подготовка последовательности). Используя программное обеспечение для молекулярного клонирования, студенты анализируют свои данные секвенирования, чтобы определить, были ли их реакции ПЦР успешными (Вспомогательный файл S14: Лаборатория 5 - Анализ последовательности, Вспомогательный файл S15: KIF17B-1 - файл .ab1, Вспомогательный файл S16: KIF17B-2.ape файл, вспомогательный файл S17: файл Unknown.ab1 и рисунок 1B). Шаблоны HDR с подтвержденной последовательностью затем сохраняются для дальнейшего использования при желании.


Рисунок 1. Амплификация шаблонов гомологически направленной репарации (HDR) mCherry. (A) Типичный агарозный гель продуктов реакции ПЦР для HDR-шаблонов 1-4. Ожидаемый размер продуктов ПЦР mCherry с плечами гомологии составляет 935 пар оснований. (B) Студент выровнял результаты секвенирования, демонстрирующие успешную амплификацию mCherry для HDR Template-3. Нуклеотиды 61-100 mCherry показаны для краткости. Выравнивание последовательностей производили с использованием программного обеспечения ApE.

МОДУЛЬ 2: ПРОИЗВОДСТВО РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК - КОНСТРУКЦИЯ РНК-ПЛАЗМИДОВ С ОДНОЙ НАПРАВЛЯЮЩЕЙ РНК

Однонаправляющие РНК (sgRNAs) для сайт-специфического нацеливания Cas9 конструируются с использованием аннотированной геномной последовательности целевого гена (вспомогательный файл S18: Lab 6 - Designing crRNA Oligos). Напомним, что полная sgRNA содержит два связанных компонента: специфическую CRISPR-РНК (crRNA), которая нацелена на конкретную последовательность ДНК, и универсальную трансактивирующую CRISPR-РНК (tracrRNA), которая связывает crRNA с ферментом Cas9. Hwang et al. разработали плазмиду DR274 (Addgene Plasmid # 42250, требуется MTA), которая содержит сайт встраивания crRNA, за которым следует последовательность tracrRNA. Чтобы использовать эту плазмиду, пользователям нужно только сконструировать и отжечь комплементарные олигонуклеотиды, соответствующие желаемой последовательности crRNA. Важно отметить, что DR274 был разработан для направленной (односторонней) вставки отожженных олигонуклеотидов crRNA. DR274 содержит два сайта рестрикционного фермента BsaI, разделенных спейсерной последовательностью. Последовательность распознавания фермента BsaI составляет 5 'GGTCTC 3', однако фермент переваривает один неспецифический нуклеотид после 3 'конца последовательности распознавания GGTCTC (5'GGTCTCN 3') и пять неспецифических нуклеотидов ближе к 5 'концу. на нижней пряди (3'CCAGAGNNNNN 5 '). Фланкирующие последовательности на сайте вставки crРНК DR274 намеренно различаются для облегчения направленной вставки олигонуклеотидов отожженной crRNA непосредственно перед последовательностью tracrRNA для получения sgRNA через in vitro транскрипция (10). Стандартные реакции лигирования используют переваренный BsaI, дефосфорилированный DR274 и отожженные олигонуклеотиды (вспомогательный файл S19: Лаборатория 7 - Подготовка плазмид sgRNA). Реакции лигирования трансформируют в компетентные бактерии и высевают на чашки с LB-канамицином для инкубации в течение ночи при 37 ° C.

Студенты выберут бактериальные клоны для ночных жидких культур и получат подробные инструкции о назначении каждого раствора, используемого для выделения ДНК (вспомогательный файл S20: Лаборатория 8 - Минипрепараты и диагностический сборник и 5). После успешного выделения ДНК плазмиды секвенируются и анализируются для дальнейшей практики в области биоинформатики. Плазмиды, содержащие кассеты crRNA, диагностически переваривают с использованием NheI и HindIII. В результате переваривания образуются фрагменты из 2018 и 143 нуклеотидов, для которых требуется высокий процент агарозного геля. Успехи в этом диагностическом сборнике различаются, но в 50% случаев учащиеся могут изготовить ремешок правильного размера. Неразрезанную плазмиду также можно запускать рядом с расщепленной плазмидой, чтобы продемонстрировать суперспирализацию по сравнению с линеаризованной ДНК (рис. 2А). Учащиеся анализируют свои гели, чтобы определить потенциально положительные клоны. Даже если диагностические обзоры не увенчались успехом, учащиеся обычно получают положительные результаты анализа последовательности, приведенного выше (рис. 2B).


Рисунок 2. Проверка клонирования плазмиды sgRNA. (A) Студент создал репрезентативный агарозный гель с использованием HindIII / NheI для выполнения диагностического расщепления четырех отдельных клонов DR274 + crRNA-3 против непереваренного суперспирального образца того же клона. Ожидаемый размер дважды переваренных положительных клонов: 2152 пары оснований и 134 пары оснований (B) Совмещение результатов секвенирования между клоном 2 DR274 + crRNA-3 и разработанной последовательностью crRNA-3. Выравнивание последовательностей производили с использованием программного обеспечения ApE.

МОДУЛЬ 3: РАБОТА С РНК - ПРОИЗВОДСТВО SGRNA

Сток in vitro транскрипция используется для производства sgRNA (вспомогательный файл S21: Лаборатория 9 - In vitro Транскрипция). Плазмиды sgRNA с подтвержденной последовательностью сначала линеаризуют с помощью DraI с последующей экстракцией фенол-хлороформом и осаждением этанолом. Студенты должны позаботиться о предотвращении загрязнения РНКазой, поскольку ДНК будут использоваться в последующих приложениях РНК. Типичные выходы Стьюдента от этой процедуры очистки колеблются от 10 до 200 нг / мкл линеаризованной матричной ДНК. sgRNA затем продуцируются in vitro транскрипция. Всего лишь 10 нг линеаризованной матричной ДНК можно использовать для in vitro реакция транскрипции. Образцы следует обработать ДНКазой, чтобы удалить матрицу ДНК после in vitro транскрипция. В пробирке полученные sgRNA очищают и подвергают денатурирующему электрофорезу в агарозном геле (вспомогательный файл S22: Lab 10 - Purification sgRNAs). Вместо использования традиционных методов денатурирующего геля Арнанда и его коллеги разработали простую эффективную альтернативу, в которой используются стандартные агарозные гели, содержащие до 5% стандартного бытового отбеливателя для денатурирования РНК (7). Образец 200-250 нг общей РНК дает полосы правильного размера (

133 нуклеотида) и пропускание большего количества РНК на гель приводит к образованию вторичной структуры РНК, плохому разрешению полос и неправильному размеру на геле (Рисунок 3).


Фигура 3. Денатурирующий отбеливающий гель транскрибированных sgRNA 1-4 in vitro. Ожидаемый размер продукта 133 базы. Обратите внимание, что реакция транскрипции sgRNA-4 in vitro дает низкий выход.

МОДУЛЬ 4: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПРОЕКТ С ПОМОЩЬЮ IN VITRO CAS9 АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ

Чтобы продемонстрировать принцип CRISPR-Cas9 и процесс экспериментального проектирования, мы используем in vitro метод (вспомогательный файл S23: лабораторная работа 11 - В пробирке Cas9 Assay и 8, также см. Https://www.neb-online.de/wp-content/uploads/2015/06/LocusModificationDetectionCas9_Protocol_0515.pdf для основы анализа). Мы создали нашу собственную синтетическую конструкцию-мишень, сконструировав специальную дцДНК, содержащую 20-нуклеотидную мишень каждой группы, за которой следует последовательность PAM. Пользовательский блок дцДНК лигируют в сайт множественного клонирования pET28a (+). Синтетическая мишень на основе вектора pET сначала линеаризуется с помощью EcoRV, чтобы обеспечить линейный субстрат для нашего анализа. При использовании этого синтетического субстрата-мишени успешное расщепление дуплексом sgRNA-Cas9 приведет к образованию продуктов

4 кб и 1,5 кб (вспомогательный файл S24: проверенные на уроке реагенты и методы и рисунок 4). Предположительно, любая двухцепочечная ДНК (плазмида, клон кДНК, продукт ПЦР и т.д.), содержащая конкретную 20-нуклеотидную последовательность-мишень, за которой следует последовательность PAM, может быть использована в качестве субстрата для этого анализа. Использование синтетической мишени имеет то преимущество, что для всех студенческих групп требуется только один общий субстрат вместо создания или получения нескольких разных мишеней. Мы рекомендуем использовать линеаризованный шаблон для этого анализа, чтобы облегчить интерпретацию результатов студентам. Студентам необходимо поддерживать среду, свободную от нуклеаз во время анализа. Если позволяет время, после того, как учащиеся продемонстрируют успешный дизайн своих реагентов, существует возможность использовать эти реагенты. in vivo или ex vivo.


Фигура 4. Расщепление сайт-специфической мишени в анализе Cas9 in vitro. Репрезентативные данные Стьюдента анализа Cas9 in vitro для sgRNAs 1-4 против синтетического субстрата-мишени. Ни sgRNA, ни sgRNA / no Cas9 не использовали в качестве контроля. Успешное расщепление производит продукты

4000 пар оснований и 1500 пар оснований.


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 1


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 2


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 3


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 4


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 5


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 6


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 7


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - 8 неделя


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - неделя 9


Таблица 1. График обучения CRISPR-Cas9 - 10–12 недели


Вызванная ишемией дисфункция эндотелиальных клеток

Отсутствие или ограничение кровоснабжения ткани миокарда играет центральную роль в развитии сердечной дисфункции при сердечной недостаточности, при этом ишемия и гипоксия, в частности, связаны с усиленным отложением ВКМ, воспалением и гибелью клеток [93, 94]. Поскольку ЭК очень важны для поддержания перфузии миокарда, они вносят свой вклад во все клинические проявления СН. Как и другие типы сердечных клеток, ЭК подвержены ишемическому повреждению, которое может повлиять на их функциональные возможности. Известно, что гипоксия нарушает целостность ЭК, что приводит к увеличению проницаемости сосудов и инфильтрации лейкоцитов [95]. Что еще более важно, в контексте реперфузии миокарда ЭК могут действовать как палка о двух концах, способствуя кровотоку и одновременно усиливая ишемическое повреждение сердца за счет повышенного окислительного стресса [96]. Действительно, понятно, что как гипоксия, так и АФК могут способствовать изменениям метилирования ДНК в ЭК, что приводит к изменениям фенотипа и функции и нарушению сосудистого гомеостаза.

Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что ЭК могут претерпевать фенотипические изменения в ответ на гипоксию, известные как эндотелиально-мезенхимальный переход (EndoMT), при котором клетки приобретают свойства, подобные фибробластам. Например, сообщалось, что как макрососудистые коронарные артерии человека (HCAEC), так и HCMECs демонстрируют мезенхимальный фенотип через 72 часа в 1% кислороде (морфологические изменения, снижение CD31, повышение SNAIL, SLUG, TWIST, S100A4 и α-гладкомышечный актин) . Это было связано с потерей фенотипа ЭК и снижением экспрессии RASAL1 из-за повышенного DNMT3A-опосредованного метилирования CpG в промоторной области [67], как ранее было показано в миокарде пациентов с терминальной стадией сердечной недостаточности [49]. Потеря поддержки сосудов в сердце из-за EndoMT в конечном итоге приводит к усилению гипоксии миокарда, тем самым способствуя дальнейшему EndoMT, потере сосудов и патологическому ремоделированию сердца. Таким образом, сохранение фенотипа EC посредством нацеливания на метилирование ДНК может представлять собой новый подход к ослаблению вызванного гипоксией EndoMT при HF.

В ответ на гипоксию активация HIF-зависимой передачи сигналов EC способствует адаптивному ангиогенному ответу на низкий уровень кислорода в окружающей среде, который, по-видимому, включает изменения метилирования ДНК. Например, HUVEC, культивированные в условиях гипоксии (0,5% кислорода) в течение 2 дней, демонстрировали повышенные внутриклеточные уровни аденозина из-за HIF-зависимого снижения уровня аденозин-метаболизирующего фермента аденозинкиназы (ADK). Это было связано с повышенной ангиогенной способностью и снижением активности DNMT и глобального гипометилирования в промоторных областях ключевых генов ангиогенеза, включая KDR, NOS3, GATA4 а также SEMA5 [68]. Напротив, другое исследование HUVEC, поддерживаемых в гипоксии в течение 16 часов, сообщило об увеличении метилирования ДНК в 5'-фланкирующей области NOS3 который содержит 13 элементов CpG, приводящих к рекрутированию MBD2 и репрессии экспрессии eNOS, которая была обращена направленным нокдауном siRNA вместе с усиленной экспрессией KDR [66]. Дополнительные анализы в Mbd2-дефицитные мыши продемонстрировали повышенную экспрессию в сосудах eNOS и экспрессию KDR и улучшенное восстановление после экспериментальной ишемии задних конечностей, о чем свидетельствует увеличение плотности капилляров и артериол по сравнению с контрольными животными дикого типа [66]. Это наблюдение может, по крайней мере, частично объяснить, почему пациенты с сосудистыми заболеваниями плохо реагируют на проангиогенные агенты, поскольку индуцированные гипоксией изменения метилирования ДНК, опосредованные эффекторными белками, такими как MBD2, могут способствовать дисфункции ЭК. Действительно, церебральные ЭК мыши (MCEC), подвергшиеся как аноксии, так и депривации глюкозы, продемонстрировали повышенное метилирование ДНК в промоторе тромбоспондина-1 (Thbs1), матричноклеточный гликопротеин, который способствует антиангиогенному действию посредством ингибирования передачи сигналов VEGF / NO и миграции / пролиферации ЭК, что приводит к снижению экспрессии Thbs1 как на уровне РНК, так и на уровне белка [69, 97, 98, 99]. Интересно, что последующее восстановление нормальных условий содержания кислорода и глюкозы в течение 4 ч привело к деметилированию в Thbs1 промотор и восстановление экспрессии генов, предполагая, что эти динамические изменения метилирования по своей природе обратимы на клеточном уровне [69]. Напротив, культура кожных микрососудистых ЭК человека (НМЕС) в условиях гипоксии (1% кислорода) в течение 24 часов, как было показано, увеличивает уровни THBS1, в то время как обработка нормоксических ЭК средой, кондиционированной гипоксическими ЭК, уменьшала пролиферацию ЭК и индуцировала апоптоз [100]. Хотя это исследование не исследовало THBS1 изменения метилирования, вполне вероятно, что дифференциальные условия культивирования и время воздействия (например, бескислородное и глюкозное голодание в течение 4 часов [69] против 1% кислорода и нормальной глюкозы в течение 24 часов [100]) и использование различных ЭК (первичные MCEC по сравнению с иммортализованными HDMEC) ) могли дать противоположные результаты. Хотя и неубедительно, эта работа в совокупности предполагает, что метилирование ДНК может играть важную роль в регуляции плейотропных факторов, таких как THBS1, в уникальных популяциях ECs в различных условиях окружающей среды.

В дополнение к уровням кислорода, сосудистая перфузия и направление кровотока, как известно, регулируют метилирование ДНК и экспрессию генов в ЭК, при этом несколько групп подчеркивают важную роль DNMT1 в модуляции функции ЭК в ответ на напряжение сдвига и дифференциальный поток. Например, повышенная ядерная экспрессия DNMT1 вместе с повышенными уровнями 5MeC была обнаружена в ЭК, подвергнутых низкому и колебательному сдвиговому напряжению, с использованием систем как in vitro, так и in vivo [70]. Точно так же повышенные уровни DNMT1 в ответ на нарушение кровотока были ослаблены обработкой 5aza [71]. Other studies have also reported increased DNMT1-mediated DNA methylation in the context of both increased shear stress (induced in vivo by vascular occlusion or in vitro using cone and plate flow apparatus) and unidirectional flow, associated with global hypermethylation of genes associated with cellular metabolism, nucleic acid turnover and transcription [72]. Interestingly, and consistent with the previously described study, increased expression of DNMT1 observed under unidirectional flow resulted in reduced monocyte adhesion to ECs which was reversed by treatment with 5azadC in both in vitro and in vivo models [72]. Notably, when ECs maintained under shear stress were exposed to reversed flow, DNMT1 expression remained unaltered whilst monocyte adhesion to ECs was increased, prompting the authors to propose that hypermethylation under shear stress with unilateral flow may limit the arteriogenic capacity of ECs, thereby preventing hypertrophy/hyperplasia which may lead to impaired perfusion and tissue hypoxia [72]. In addition to DNMT1, other DNMT enzymes have been implicated in regulating EC function in response to altered blood flow. For example, increased DNMT3A levels are reported in HAECs subjected to disturbed flow for 2 days, linked with hypermethylation at the promotor of anti-inflammatory and anti-thrombotic, KLF4, and decreased binding and expression of myocyte enhancer factor-2 [73]. DNMT3A-mediated methylation negatively impacted on downstream functional targets of KLF4 such as NOS3, THBD а также MCP1, which was rescued by treatment with pharmacological inhibitors of DNMT (RG108 and 5aza) [73].

Collectively, these studies highlight that both hypoxia and abnormal perfusion dynamics can influence DNA methylation in ECs resulting in changes to their normal physiology and behaviour, thereby promoting EC dysfunction. Whilst there is clear potential for specifically targeting this epigenetic process in ECs for treatment of HF, particularly in the context of ischaemic cardiomyopathy, further investigation is required to define underlying mechanisms.


Абстрактный

Termini often determine the fate of RNA molecules. In recent years, 3′ ends of almost all classes of RNA species have been shown to acquire nontemplated nucleotides that are added by terminal nucleotidyltransferases (TENTs). The best-described role of 3′ tailing is the bulk polyadenylation of messenger RNAs in the cell nucleus that is catalyzed by canonical poly(A) polymerases (PAPs). However, many other enzymes that add adenosines, uridines, or even more complex combinations of nucleotides have recently been described. This review focuses on metazoan TENTs, which are either noncanonical PAPs or terminal uridylyltransferases with varying processivity. These enzymes regulate RNA stability and RNA functions and are crucial in early development, gamete production, and somatic tissues. TENTs regulate gene expression at the posttranscriptional level, participate in the maturation of many transcripts, and protect cells against viral invasion and the transposition of repetitive sequences.

  • RNA Interactions with Proteins and Other Molecules > Protein-RNA Recognition
  • RNA Processing > 3′ End Processing
  • RNA Turnover and Surveillance > Regulation of RNA Stability

Bruce A. Shapiro, Ph.D.

Dr. Shapiro directs research on computational and experimental RNA structure prediction and analysis and has pioneered research in the emerging field of RNA nanobiology. His work has led to several novel RNA folding and analysis algorithms, experimental techniques and discoveries in RNA biology. His interests include RNA nanobiology, nucleic acid structure prediction and analysis, the relationships between RNA structure and function. His has fostered a synergy between computational and experimental techniques, where computationally designed novel RNA based nanostructures have been shown to be able to self-assemble as predicted and be delivered to cell cultures and mouse models to control gene expression and thus show potential for use in RNA-based therapeutics. For additional information, please visit our web site at http://www-CCRNP.ncifcrf.gov/

1) RNA structure, 2) RNA folding, 3) RNA nanobiology – computational and experimental, 4) computational RNA structure prediction and analysis, 5) molecular dynamics, 6) RNA 3D modeling

Контактная информация

A complete understanding of the function of RNA molecules requires knowledge of their higher order structures (2D and 3D) as well as the characteristics of their primary sequence. RNA structure is important for many functions, including regulation of transcription and translation, catalysis, transport of proteins across membranes and the regulation of RNA viruses. The understandings of these functions are important for basic biology as well as for the development of drugs that can intervene in cases where pathological functionality of these molecules occurs.

Our group does research and development of methodologies for improving RNA folding and analysis techniques to help further our understanding of the functional properties of these molecules. In addition, we are focusing on the emerging field of RNA nanobiology. RNA represents a relatively new molecular material for the development of biologically oriented nano devices. It is an interesting material because of its natural functionalities, its ability to fold into complex structures and self-assemble. We have developed computational and experimental methodologies that permit the design of RNA-based nanoparticles that potentially have a variety of uses. Thus, our research on RNA covers five highly related and integrated areas of research:

  1. Research in algorithms for RNA secondary structure prediction and analysis
  2. RNA biology and its relationship to sequence and secondary structure folding characteristics
  3. Research in algorithms for RNA 3D structure prediction and analysis and their application to RNA biology
  4. Research in algorithms for the design and analysis of RNA nanoparticles
  5. Experimental design, synthesis and delivery of RNA-based nanoparticles.

What is learned in one area is applied to the other areas, enhancing our understanding of RNA structure, function, and RNA nanobiology and self-assembly.

Parallel Computational Biology and RNA Structure
Revolutionary changes in computational paradigms are required to maintain the necessary computational power to solve problems in molecular biology. Methodologies based on sequential computer architectures could not be expected to continually keep pace with the needed computational speeds. In order to accommodate the high speeds that are necessary, highly parallel computational techniques are now employed. Our group was one of the pioneers in the area of computational biology and the use of parallel high performance computer architectures for this endeavor.

Computational Techniques for RNA Secondary Structure Prediction and Analysis
We were the first to develop an RNA folding technique that uses concepts from genetic algorithms. Our algorithm, MPGAfold, was originally developed to run on a massively parallel SIMD supercomputer, a MasPar MP-2 with 16384 processors. This algorithm was modified and now runs on parallel high performance Linux clusters. Exceptional scaling characteristics are obtained with the ability to run the algorithm with hundreds of thousands of population elements. RNA pseudoknot prediction is part of the genetic algorithm, resulting in its ability to predict tertiary interactions. Other features include simulation of co-transcriptional folding, the ability to incorporate different energy rules, and the forced inhibition and embedding of desired helical stems. In addition, STRUCTURELAB, our heterogeneous bioinformatical RNA analysis workbench, can be used in conjunction with MPGAfold and RNA2D3D to produce predicted 3D atomic coordinates of RNA structures along with the visualization of these structures. Also, we developed a novel interactive visualization methodology that is part of STRUCTURELAB. This technique enables the comparison and analysis of multiple sequence RNA folds from a phylogenetic point of view, thus allowing improvement of predicted structural results across a family of sequences.

We developed KNetFold, a novel and powerful algorithm for RNA structure prediction from sequence alignments. The algorithm uses a unique hierarchical classification network based on mutual information, thermodynamics and Watson-Crick base-pairedness to predict structures. In addition, we have developed a web-based application, CorreLogo, that uses mutual information derived from RNA sequence alignments to determine covariations amongst base-paired positions. The algorithm includes a unique error measure and depicts results in 3D.

We developed, CyloFold, a unique algorithm for predicting, from a single sequence, RNA secondary structures that may include pseudoknots. This algorithm utilizes a novel technique that approximates the potential for 3D steric clashes in the predicted structures, thus filtering out those structures from consideration. The algorithm has been shown to have high accuracy when compared to other algorithms of its type.

We developed web software based on a Bayesian statistical approach that estimates the accuracy of base pair formation from data derived from SHAPE (Selective 2' - Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension) experiments. The statistical/probabilistic results were derived by analyzing known RNA 3D structures having various types of known base interactions, and correlating them with SHAPE values. It was shown that low SHAPE values correlate well with Watson-Crick base pairing and stacking interactions while high SHAPE values indicate single stranded regions. Improvements could be seen if a 2 or 3 base context was also taken into account. We also showed that other types of known interactions did not correlate well. This type of information is helpful in ultimately determining the secondary structure of RNAs.

Computational Studies of RNA Folding Pathways
RNA folding pathways are proving to be quite important in the determination of RNA function. Studies indicate that RNA may enter intermediate conformational states that are key to its functionality. These states may have a significant impact on gene expression. It is known that the biologically functional states of RNA molecules may not correspond to their minimum energy state, that kinetic barriers may exist that trap the molecule in a local minimum, that folding often occurs during transcription, and cases exist in which a molecule will transition between one or more functional conformations before reaching its native state. Thus, methods for simulating the folding pathways of an RNA molecule, including co-transcriptional folding, and locating significant intermediate states are important for the prediction of RNA structure and its associated function. Several biological RNA folding pathways have been successfully studied using MPGAfold and STRUCTURELAB. Examples include the potato spindle tuber viroid, the host-killing mechanism of кишечная палочка plasmid R1, the hepatitis delta virus, HIV, and the dengue virus. These computational results are consistent with those derived from biological experiments. In addition, novel structural interactions and important functional intermediate and native states have been predicted. These have led to further successful confirmatory experiments.

Computational Prediction of RNA Interaction Networks
We have also developed programs CovaRna and CovStat to explore long-range co-varying RNA interaction networks using whole genome alignments. This new methodology, which was applied to Дрозофила genomes, is currently being applied to other genomes. A parallel version of the program was devised to speed-up processing and the algorithms also rely on fast indexing schemes and conservative statistical methods to determine highly significant interactions. The methodology has found interesting interactions that are related to endogenous siRNAs, gene transport and genes related to morphogenesis.

Computational Studies of Three-Dimensional RNA Structures
Some structural elements of RNA molecules have been studied using molecular mechanics and molecular dynamics simulations. The structures examined include an RNA tetraloop where temperature-dependent denaturation of the tetraloop and the subsequent refolding to the original crystal structure were performed. A three-way junction from the core central domain of the 30S ribosomal subunit from Термус термофильный was explored. It has been experimentally determined that the intermolecular interactions between the three-way junction and the S15 ribosomal protein initiate the process of the assembly of the 30S ribosomal subunit. By using molecular dynamics simulations we obtained insights into the conformational transitions of the junction associated with the binding of S15. We determined using, molecular dynamics simulations, the structural effects of utilizing new types of modified RNA nucleotides containing carbocyclic sugars that are constrained to north or south conformations (C2' or C3' exo). In addition, we showed using molecular dynamics simulations, how ions and flanking bases play a very important role in human immunodeficiency virus (HIV) kissing loop monomer conformations. These results correlate well and may explain in detail, experimental studies that indicate the importance of ions for HIV-1 dimerization.

We have also examined the pseudoknot domain of telomerase. Molecular modeling and molecular dynamics of the pseudoknot domain, including its hairpin loop, were performed. Results indicated how the hairpin loop dynamics affected the opening and closing of the non-canonical U-U base pairs found in the stem. The opening suggested nucleation points for the formation of the pseudoknot. We have also examined the effect of dyskeratosis congenita (DKC) mutations in the loop and how they reduced the propensity for the opening of the stem by forming a relatively stable hydrogen bond network in the hairpin loop. We modeled the pseudoknot itself using our RNA2D3D software combined with phylogenetic analysis. We studied the dynamical impact of the DKC mutations on the pseudoknot with the result that the pseudoknot became unstable while the hairpin form became more stable.

We discovered and elucidated the 3D structures of new types of translational enhancers that are found in the 3' UTRs of the Turnip Crinkle Virus (the first of its kind found) and the Pea enation Mosaic Virus. The discovery of these structural elements has brought to light new mechanisms for translational enhancement in eukaryotic plant viruses that may have broader implications for understanding translational mechanisms in general. This was accomplished with the combined use of MPGAfold, our 3D molecular modeling software RNA2D3D, and close interactions with our experimental collaborators. We also modeled a novel pseudoknot found in the CCR5 mRNA. This pseudoknot is involved in frameshifting and appears to be stabilized by a microRNA, a novel function for a microRNA.

In addition, we have employed methods based on elastic network interpolation to reduce the computational costs related to RNA 3D dynamics. Three-dimensional dynamics trajectories can be determined using a reduced atom representation and given conformational states. Compute time can be reduced from weeks to hours using this approach.

Computational RNA Nanobiology
RNA nanobiology represents a new modality for the development of nanodevices that have the potential for use in a number of areas, including therapeutics. Building on our experience as outlined above, we developed several computational and experimental techniques (see below) that provide a means to determine a set of nucleotide sequences that can assemble into desired nano complexes. One of these tools is a relational database called RNAJunction. The database contains structure and sequence information for known RNA helical junctions and kissing loop interactions. These motifs can be searched for in a variety of ways, providing a source for RNA nano building blocks. Another computational tool, NanoTiler, permits a user to construct specified RNA-based nanoscale shapes. NanoTiler provides a 3D graphical view of the objects being designed and provides the means to work interactively or with computer scripts on the design process even though the precise RNA sequences may not yet be specified, and an all-atom model is not available. NanoTiler can use the 3D motifs found in the RNAJunction database with those derived from specified RNA secondary structure patterns to build a defined RNA nano shape. Also, a combinatorial search can be applied to enumerate structures that would not normally be considered.

Another web-based software tool for RNA nanostructure design is NanoFolder, which is one of the few software tools that are capable of predicting the structure and sequence attributes of multi-stranded RNA constructs. With this software it is possible to specify the desired secondary structure motifs and have the software predict the set of sequences that generate these desired motifs with the correct intra- and inter-strand folding characteristics.

Experimental RNA Nanobiology
Based on the above described computational approaches to RNA nanodesign we have demonstrated the ability to experimentally self-assemble and functionalize several RNA-based nanoparticles. This was accomplished with close interactions between the experimental and computational approaches leading to enhancements to both sets of methodologies. Examples include the self-assembly of 6 and 10 stranded cubes the self-assembly of hexagonal rings of various sizes and double rings utilizing an RNA motif extracted from nature the modification of sequences in the motif to improve yield while also maintaining appropriate geometries and the self-assembly of triangular structures. We also developed techniques that define self-assembly protocols and that allow for co-transcriptional assembly of constructs that can also include modified bases to increase the chemical stability of these nanoparticles. In addition, we have functionalized these particles with up to six different siRNAs to enable controlled stoichiometry and gene silencing, and showed that these particles do indeed silence the designated genes when transfected into various cell lines.

We have also been exploring another paradigm based on the use of RNA/DNA hybrid nanoconstructs containing split functionalities. This allows, for example, the splitting of a Diceable siRNA into two DNA/RNA hybrid components with DNA toeholds, which when transfected into cells reassembles into a DNA duplex and a Diceable siRNA. This hybrid approach has been incorporated in our hexagonal nanorings and nanocubes. The utility of this approach permits, amongst other things, controlled activation of functionalities, incorporation of molecular beacons on the DNA strands without intefering with RNA functionality and resistance to nuclease degradation. This approach has been tried successfully in cell cultures and xenograph tumor mouse models.